الکتروفورز چیست و چه کاربردی دارد؟ (Gel Electrophoresis)
الکتروفورز
الکتروفورز روشی است که برای جدا کردن قطعات DNA (یا ماکرومولکول های دیگر مانند RNA و پروتئین) بر اساس اندازه و بار الکتریکی آنها استفاده می شود. روش الکتروفورز با ایجاد جریان الکتریکی که از ژل می گذرد موجب حرکت مولکول های مورد نظر – بر اساس اندازه و بار – در جهات مختلف یا با سرعت های متفاوتمی شود و به این ترتیب، مولکول ها از یکدیگر جدا می شوند.
تمام مولکولهای DNA، بر اساس جرم دارای مقدار یکسانی از بار الکتریکی هستند. به همین دلیل، الکتروفورز، قطعات DNA را تنها براساس اندازه آنها جدا می کند. با استفاده از الکتروفورز، می توانیم قطعات مختلف DNA در یک نمونه را مشاهده کنیم و به صورت نسبی، اندازه آنها را مقایسه نماییم. همچنین می توانیم اندازه دقیق یک قطعه DNA را با مقایسه کردن آن در کنار یک معیار استاندارد که از قطعات DNA با اندازه های شناخته شده ساخته شده است، بدست آوریم. به این معیار استاندارد Ladder می گویند.
ژل الکتروفورز چیست؟
فرآیند الکتروفورز نیازمند ژل می باشد. ژل جداسازی دی ان ای، اغلب از پلی ساکاریدی به نام آگاروز ساخته می شود که به صورت دانه های خشک و پودری قابل دسترس می باشد. هنگامی که آگارز در یک بافر (ترکیب آب با مقدار کمی نمک) گرم شده و سپس خنک می شود، یک ژل جامد و نیمه شفاف تشکیل می دهد. در سطح مولکولی، ساختار ژل یک به صورت یک شبکه از مولکولهای آگاروز است که توسط پیوندهای هیدروژنی به یکدیگر متصل شده و منافذی کوچک را تشکیل داده اند.
در یک سمت، ژل دارای حفره هایی به شکل جیب، به نام چاهک است که نمونه های DNA در آن قرار می گیرند.
قبل از قرار دادن نمونه DNA در چاهک، ژل باید در یک تانک اکلتروفورز قرار گیرد. یک انتهای تانک به یک الکترود مثبت وصل شده است، در حالی که انتهای دیگر به الکترود منفی متصل گردیده است. قسمت اصلی تانک الکتروفورز، جایی است که ژل در آن قرار داده می شود و با یک محلول بافر (که حاوی نمک برای انتقال جریان الکتریکی است) پر می شود. الکترود منفی سمت چاهک ها و الکترود مثبت سمت مقابل ژل قرار می گیرند.سپس دی ان ای مورد نظر که می تواند خروجی PCR باشد را در یکی از چاهک ها قرار داده و همیشه یکی از چاهک ها را برای Ladder که به عنوان مرجع و حاوی دی ان ای با اندازه های شناخته شده است در نظر می گیریم. سپس دستگاه تانک الکتروفورز را روشن کرده و در اثر اعمال ولتاژ، جریان الکتریکی در بافر برقرار می شود. قطعات دی ان ای که به دلیل دارا بودن گروه فسفات دارای بار منفی هستند از درون ساختار شبکه ای ژل، شروع به حرکت به سمت قطب مثبت کرده و در این وضعیت به اصطلاح ژل در حال Run می باشد.
پس از پایان فرآیند الکتروفورز و Run شدن ژل، قطعات DNA بر اساس اندازه جدا می شوند. قطعات بلند تر نزدیک تر به چاهک (الکترود منفی و یا به عبارتی ابتدای ژل) و قطعات کوچکتر نزدیک بیشتر حرکت کرده و به انتهای ژل (الکترود مثبت) نزدیک تر خواهند شد.
پس از پایان اجرای الکتروفورز و Run شدن ژل، قطعات تفکیک شده دی ان ای را می توان در ژل با استفاده از سیستم های ژلداک مشاهده و به صورت بصری به لحاظ کیفی بررسی کرد. همچنین با استفاده از نرم افزار های تحلیل تصویر ثبت شده از ژل مانند GeneTools این امکان وجود خواهد داشت تا به صورت کمی و با دقت بالا تحلیل مورد نظر بر روی تصویر ژل الکتروفورز انجام شود.
یک مجموعه دی ان ای که به شکل خطی در تصویر ژل کاملا از سایر مجموعه ها تفکیک شده اند را باند می نامند. هر باند شامل مقادیر زیادی از قطعات دی ان ای با اندازه ی یکسان می باشد. باند ها در مسیر هایی که به آنها Lane و یا Track گفته می شود در راستای الکترود منفی به سمت الکترود مثبت قرار می گیرند. به این نکته توجه داشته باشید که باند ها به خودی خود بر روی ژل قابل رویت نخواهند بود و با استفاده از رنگ های مختلف می توانند رنگ آمیزی شده و بر اساس رنگ بکار رفته، با استفاده از منبع نور مناسب (که می تواند UV و یا هر طول موج دیگری مانند IR، Red، Green و یا Blue باشد) تحریک شده و با فیلتر شدن نور ساطع شده، توسط دستگاه های ژلداک تصویر باند ها ثبت خواهد شد.
نسل بعدی توالی یابی (NGS)
توالی یابی DNA مسیر طولانی را پس از روزگار استفاده از کروماتوگرافی دو بعدی در دهه ۱۹۷۰ طی کرده است. با ظهور روش خاتمه زنجیره سنگر (Sanger Chain Termination) در سال ۱۹۷۷، دانشمندان توانایی توالی یابی DNA را به شیوه ای قابل اطمینان و قابل تایید بدست آوردند. یک دهه بعد Applied Biosystems نخستین دستگاه توالی یابی خودکار با که بر اساس الکترو فورز مویینه (Capillary Electrophoresis) کار می کرد تولید و به بازار معرفی کرد. دستگاه های AB370 در سال ۱۹۸۷ و AB3730xl در سال ۱۹۹۸ را روانه بازار شدند که به عنوان تجهیزات اصلی برای پروژه ه ای ژنوم انسانی، که تحت رهبری NIH و Celera اجرا می شد، به کار گرفته شدند.
در حالی که این دستگاه های نسل اول توالی یابی در طول زمان، توانایی بالایی برای دوره زمانی خود داشتند،Genome Analyser در سال ۲۰۰۵ ظهور کرد و قابلیت توالی یابی را از ۸۴ کیلوباز (kb) در هر اجرا به ۱ گیگاباز رساند. تکنیک توالی یابی با خوانش کوتاه و توالی یابی موازی با حجم بسیار بالا یک رویکرد اساسا متفاوت بود که انقلابی در این عرصه بوجود آورد و قابلیت و سرعت توالی یابی را افزایش داد و نسل بعدی توالی یابی (NGS) را بوجود آورد.
نسل بعدی توالی یابی (NGS)
در سال ۲۰۰۵، تنها یک اجرا با استفاده از دستگاه ژنوم آنالایزر می توانست تقریبا یک گیگاباز داده تولید کند. تا سال ۲۰۱۴، این نرخ به ۱٫۸ تراباز (tb) تنها در یک تک اجرا افزایش یافت که افزایش چشمگیر ۱۰۰۰ برابری را موجب شده بود. این نکته می تواند قابل توجه باشد که اولین توالی یابی کامل ژنوم انسانی که در سال ۲۰۰۱ در Science and Nature به چاپ رسید، ۱۵ سال طول کشید و تقریبا سه میلیارد دلار هزینه برداشت. در مقابل سیستم HiSeq X® Ten که در سال ۲۰۱۴ عرضه شده است، می تواند بیش از ۴۵ ژنوم انسان را تنها در یک روز با هزینه ی ۱۰۰۰ دلار برای هر یک از نمونه ها توالی یابی کند. فراتر از افزایش قابل توجهی که در خروجی داده ها بوجود آمده، معرفی فناوری NGS نگرش دانشمندان را درباره اطلاعات ژنتیکی به کلی تغییر داده است. توالی یابی ژنوم با این سرعت و هزینه، امکان توالی یابی در سطح جمعیتی وسیع را ایجاد می کند و می تواند پایه و اساس پزشکی ژنوم فردی را به عنوان بخشی از استاندارد مراقبت های پزشکی، بوجود آورد. محققان اکنون می توانند هزاران و یا حتی ده ها هزار ژنوم را در سال تجزیه و تحلیل کند. همانطور که اریک لاندر، مدیر موسس MIT و هاروارد و رهبر اصلی پروژه Human Genome، اظهار داشته:
“میزان پیشرفت خیره کننده است. همانطور که هزینه ها همچنان پایین می آیند، ما وارد دوره ای می‌شویم که قادر خواهیم بود فهرست کامل ژن های بیماری ها را در اختیار داشته باشیم. این فهرست به ما اجازه خواهد داد تا داده های هزاران نفر را بررسی کرده و تفاوت ها را بین آنها بهتر مشاهده کنیم تا بتوانیم ژن‌های معیوب که باعث سرطان، اوتیسم، بیماری قلبی، یا اسکیزوفرنی می شوند را شناسایی کنیم.”