اصول، روش‌ها، کاربردها و فناوری‌های نوین در زیست‌شناسی مولکولی و تشخیص مولکولی

1- مقدمه

پیشرفت علوم زیست‌شناسی مولکولی در دهه‌های اخیر وابستگی بسیار زیادی به توانایی محققان این حوزه در تخلیص ، اصلاح و انتقال مولکول‌های DNA داشته است. در میان ابزارهای مختلف مورد استفاده در مهندسی ژنتیک، پلاسمیدها یکی از مهم‌ترین و پرکاربردترین عناصر محسوب می‌شوند.

از نخستین مطالعات انجام‌شده بر روی عوامل انتقال‌دهنده ژنتیکی در باکتری‌ها تا توسعه فناوری‌های پیشرفته‌ای مانند CRISPR/Cas، پلاسمیدها به عنوان ابزارهای اصلی انتقال و بیان ژن شناخته شده‌اند.

امروزه تقریباً در تمام آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، تشخیصی و صنعتی که با فناوری DNA سروکار دارند، استخراج پلاسمید یکی از مراحل کلیدی محسوب می‌شود. پلاسمیدهای استخراج شده می‌توانند به عنوان:

حامل ژن‌های مورد مطالعه (Gene Carrier)

وکتورهای کلونینگ (Cloning Vectors)

وکتورهای بیان پروتئین (Expression Vectors)

کنترل‌های مثبت در تست‌های مولکولی

مواد اولیه تولید برخی کیت‌های تشخیصی مورد استفاده قرار گیرند.

در حوزه تشخیص مولکولی، کیفیت پلاسمید اهمیت ویژه‌ای دارد؛ زیرا بسیاری از آزمایشگاه‌ها از پلاسمیدهای استاندارد شده به عنوان Positive Control، استانداردهای کمی (Quantification Standards) یا مواد مرجع در توسعه و اعتبارسنجی کیت‌های PCR و Real-Time PCR استفاده می‌کنند.

به همین دلیل، روش استخراج پلاسمید تنها یک فرآیند جداسازی DNA نیست، بلکه یک مرحله تعیین‌کننده در تضمین کیفیت نتایج آزمایشگاهی محسوب می‌شود.

2- پلاسمید چیست؟

پلاسمیدها مولکول‌های کوچک DNA دو رشته‌ای (Double-Stranded DNA) هستند که معمولاً به صورت حلقوی  (Circular DNA)  در سلول‌های باکتریایی یافت می‌شوند و توانایی همانندسازی مستقل از DNA کروموزومی میزبان را دارند.

بر خلاف DNA کروموزومی که اطلاعات ژنتیکی اصلی سلول را ذخیره می‌کند، پلاسمیدها معمولاً حامل ژن‌هایی هستند که مزیت‌های خاصی برای سلول ایجاد می‌کنند؛ مانند:

مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها

تولید آنزیم‌های خاص

توانایی استفاده از منابع غذایی ویژه

عوامل بیماری‌زایی در برخی باکتری‌ها

اندازه پلاسمیدها می‌تواند از چند هزار جفت باز (bp) تا صدها هزار جفت باز متغیر باشد. در مهندسی ژنتیک، محققان از پلاسمیدهای طراحی‌شده مصنوعی استفاده می‌کنند که به آن‌ها وکتور (Vector) گفته می‌شود.

این وکتورها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که امکان ورود ، تکثیر و بیان یک قطعه DNA هدف را در سلول میزبان فراهم کنند.

3- ساختار پلاسمیدهای مهندسی شده

یک پلاسمید مورد استفاده در آزمایشگاه معمولاً دارای چند بخش عملکردی مهم است:

3-1 مبدأ همانندسازی (Origin of Replication)یا Ori

این بخش مسئول شروع فرآیند تکثیر پلاسمید داخل سلول میزبان است.

نوع Ori تعیین می‌کند که پلاسمید:

High Copy Number باشد (تعداد نسخه زیاد) یا Low Copy Number باشد (تعداد نسخه محدود)

پلاسمیدهای High Copy معمولاً برای استخراج DNA با مقدار بالا مناسب هستند.

3-2 ژن نشانگر انتخابی (Selectable Marker)

این قسمت معمولاً یک ژن مقاومت آنتی‌بیوتیکی است که امکان انتخاب سلول‌هایی را که پلاسمید را دریافت کرده‌اند فراهم می‌کند.

نمونه‌ها:

Ampicillin resistance (AmpR)

Kanamycin resistance (KanR)

Chloramphenicol resista

nce (CmR)

3-3  ناحیه کلونینگ چندگانه (Multiple Cloning Site یا  MCS)

این بخش شامل مجموعه‌ای از جایگاه‌های آنزیم‌های محدودکننده (Restriction Sites) است که امکان ورود قطعه DNA مورد نظر را فراهم می‌کند.

 4-3 عناصر تنظیم بیان ژن و Promoter

در پلاسمیدهای بیان پروتئین، وجود Promoter مناسب برای کنترل بیان ژن ضروری است.

نمونه‌ها:

T7 promoter

CMV promoter

Lac promoter

4- اهمیت استخراج و تخلیص پلاسمید در کاربردهای آزمایشگاهی و صنعتی

استخراج پلاسمید تنها به معنای جداسازی DNA از سلول باکتریایی نیست، بلکه هدف اصلی دستیابی به یک مولکول DNA با کیفیت، خلوص و یکپارچگی مناسب برای کاربردهای بعدی است.

وجود ناخالصی‌هایی مانند پروتئین‌ها، RNA، لیپوپلی‌ساکاریدها (LPS)، نمک‌ها، مواد شیمیایی باقی‌مانده از فرآیند استخراج و اندوتوکسین‌ها می‌تواند موجب کاهش عملکرد پلاسمید در آزمایش‌های حساس شود.

کیفیت پلاسمید استخراج شده مستقیماً بر عملکرد مراحل زیر تأثیرگذار است:

4-1 کلونینگ ژن (Gene Cloning)

در فرآیند کلونینگ، قطعه DNA مورد نظر به داخل یک وکتور پلاسمیدی وارد شده و سپس به سلول میزبان منتقل می‌شود.

DNA پلاسمیدی با کیفیت پایین ممکن است باعث کاهش راندمان لیگیشن (Ligation) و کاهش راندمان Transformationو ایجاد کلون‌های غیرصحیح شود.

4-2 واکنش PCR و Real-Time PCR

در بسیاری از آزمایشگاه‌های تشخیص مولکولی، پلاسمیدها به عنوان:

کنترل مثبت  (Positive Control)، استانداردهای کمی  (Quantitative Standards) و کنترل‌های توسعه کیت استفاده می‌شوند.

یک پلاسمید استاندارد باید توالی تأیید شده داشته باشد همچنین غلظت مشخص و مناسب داشته و فاقد مواد مهارکننده PCR باشد.

وجود نمک‌ها یا اتانول باقی‌مانده از فرآیند شستشو می‌تواند موجب مهار آنزیم DNA Polymerase و ایجاد نتایج کاذب شود.

4-3 تعیین توالی DNA (DNA Sequencing)

برای Sequencing موفق، کیفیت DNA اهمیت بسیار بالایی دارد.

پارامترهای مهم عبارتند از:

خلوص بالا ، نسبت مناسب  A260/A280، عدم وجود DNA تخریب‌شده و میزان کافی DNA Template

پلاسمیدهای آلوده به RNA یا پروتئین ممکن است باعث ایجاد Peak های نامناسب در Sanger Sequencing، کاهش کیفیت خوانش و ایجاد خطا در تفسیر توالی شوند.

4-4 ترانسفکشن سلولی (Cell Transfection)

در مطالعات بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب، پلاسمید باید وارد سلول‌های یوکاریوتی شود.

در این کاربرد، علاوه بر خلوص DNA، حذف اندوتوکسین اهمیت بسیار زیادی دارد.

اندوتوکسین‌های حاصل از دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی مانند E. coli می‌توانند پاسخ التهابی سلول را تحریک کنند، سمیت سلولی ایجاد کرده و میزان بیان ژن را کاهش دهند، به همین دلیل برای کاربردهای سلولی معمولاً از روش‌های Endotoxin-Free Plasmid Purification استفاده می‌شود.

5-اصول کلی استخراج پلاسمید

اگرچه روش‌های مختلفی برای استخراج پلاسمید توسعه یافته است، اما تقریباً همه روش‌ها بر اساس چند مرحله اصلی انجام می‌شوند:

رشد سلول میزبان حاوی پلاسمید، برداشت سلول‌های باکتریایی، تخریب دیواره و غشای سلولی، آزادسازی DNA پلاسمیدی، حذف پروتئین‌ها و DNA کروموزومی، اتصال DNA به یک سطح جامد یا جداسازی اختصاصی، شستشو و حذف ناخالصی‌ها و بازیابی DNA خالص (Elution)

6- روش Alkaline Lysis؛ روش کلاسیک و استاندارد استخراج پلاسمید

روش Alkaline Lysis یکی از رایج‌ترین و استانداردترین روش‌های استخراج پلاسمید است که اولین بار توسط Birnboim و Doly در سال 1979 معرفی شد.

این روش بر اساس تفاوت حساسیت DNA پلاسمیدی و DNA کروموزومی نسبت به شرایط قلیایی و سپس خنثی‌سازی سریع استوار است.

اصول این روش:

سلول‌های باکتریایی تحت شرایط قلیایی باز می‌شوند.

DNA، پروتئین‌ها و ترکیبات سلولی آزاد می‌شوند.

DNA پلاسمیدی کوچک و حلقوی پس از خنثی‌سازی دوباره به فرم طبیعی خود بازمی‌گردد.

DNA کروموزومی بزرگ و پروتئین‌ها رسوب کرده و حذف می‌شوند.

7-  مراحل اصلی Alkaline Lysis

 

مرحله اول: رشد باکتری (Bacterial Culture)

ابتدا سلول‌های باکتریایی معمولاً سویه‌های مهندسی‌شده E. coli که دارای پلاسمید هدف هستند، در محیط کشت مناسب رشد داده می‌شوند.

عوامل مهم در پروسه ی رشد مشتمل بر نوع سویه باکتری، نوع پلاسمید، آنتی‌بیوتیک انتخابی، زمان و شرایط انکوباسیون می باشند که بر میزان بازده استخراج تأثیر دارند.

سویه‌هایی مانند DH5α ،TOP10 و XL1-Blue به دلیل پایداری ژنتیکی و قابلیت تکثیر پلاسمید، کاربرد گسترده‌ای دارند.

 مرحله ی دوم : بازسازی سلولی (Resuspension)

در این مرحله رسوب سلولی در یک محلول اولیه معلق می‌شود.

Buffer شماره 1 معمولاً شامل:

Tris-HClبرای حفظ pH مناسب، EDTA برای اتصال یون‌های دو ظرفیتی مانند Mg²⁺ و Ca²⁺ و کاهش فعالیت نوکلئازها و

RNase Aبرای حذف RNA موجود در نمونه می باشد.

نقش این مرحله یکنواخت کردن سلول‌ها، محافظت از DNA پلاسمیدی و آماده‌سازی برای لیز سلولی می باشد .

مرحله سوم: Cell Lysis

در این مرحله با افزودن محلول قلیایی، سلول‌ها تخریب می‌شوند.

Lysis Buffer معمولن شامل Sodium Hydroxide (NaOH) است که موجب تخریب غشا ، دناتوره شدن DNA و باز شدن ساختارهای پروتئینی می‌شود.

SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) یک دترجنت آنیونی است که لیپیدهای غشایی را حل می‌کند و پروتئین‌ها را دناتوره می‌کند. در این مرحله DNA پلاسمیدی و کروموزومی هر دو دناتوره می‌شوند.

مرحله چهارم: Neutralization

پس از لیز، محلول خنثی‌کننده اضافه می‌شود که این محلول حاوی Potassium acetate است.

این محلول موجب کاهش سریع pH، بازگشت پلاسمید به ساختار طبیعی ، رسوب SDS و پروتئین‌ها و رسوب DNA کروموزومی بزرگ می شود . به دلیل اندازه کوچک و ساختار حلقوی، پلاسمید بیشتر در محلول باقی می‌ماند.

*نکته مهم علمی:

اختلاف اصلی بین DNA پلاسمیدی و DNA کروموزومی در این مرحله مشخص می‌شود.

DNA پلاسمیدی: کوچک‌تر است ، سریع‌تر Renaturation انجام می‌دهد و در محلول باقی می‌ماند.

DNA کروموزومی: بزرگ و خطی است و همراه پروتئین‌ها رسوب می‌کند.

8- روش‌های مدرن تخلیص پلاسمید (Modern Plasmid Purification Methods)

پس از مرحله Alkaline Lysis، محلول، حاوی DNA پلاسمیدی، پروتئین‌ها، RNA، نمک‌ها و سایر ترکیبات سلولی است. برای دستیابی به DNA با کیفیت بالا، نیاز به یک مرحله تخلیص مؤثر وجود دارد.

امروزه روش‌های جدید تخلیص پلاسمید با هدف افزایش خلوص DNA، کاهش زمان استخراج ، حذف مواد مهارکننده ی واکنش‌های آنزیمی، قابلیت انجام تعداد زیادی نمونه و امکان اتوماسیون توسعه یافته‌اند.

مهم‌ترین روش‌های مدرن عبارتند از:

روش ستون‌های غشایی سیلیکا (Silica Membrane Column-Based Purification)

روش ذرات مغناطیسی (Magnetic Bead-Based Purification)

سیستم‌های اتوماتیک استخراج پلاسمید

8-1 تخلیص پلاسمید با ستون سیلیکا (Silica Column Purification)

این روش یکی از پرکاربردترین تکنیک‌های تجاری برای استخراج پلاسمید است و اساس بسیاری از کیت‌های موجود در بازار را تشکیل می‌دهد.

اصل این روش بر اساس اتصال انتخابی DNA به غشای سیلیکا در حضور غلظت بالای نمک‌های کائوتروپیک (Chaotropic Salts) است.

مراحل اصلی:

Binding-1

پس از مرحله Neutralization، محلول حاوی DNA پلاسمیدی به ستون سیلیکا منتقل می‌شود.

در حضور نمک‌های مناسب ، مولکول‌های آب اطراف DNA کاهش یافته و DNA  به سطح سیلیکا متصل می‌شود.

Washing-2

در این مرحله با استفاده از محلول‌های شستشو  ، نمک‌ها ، پروتئین‌ها ، بقایای SDS و ترکیبات سلولی حذف می‌شوند.

معمولاً محلول‌های Wash شامل: اتانول و بافرهای دارای غلظت یونی کنترل شده می باشند.

Elution-3

در مرحله نهایی، DNA خالص با استفاده از:

آب بدون نوکلئاز (Nuclease-Free Water) یا بافر کم‌نمک مانند TEاز ستون جدا می‌شود.

مزایای روش Silica Column:

✓  سرعت بالا

✓  تکرارپذیری مناسب

✓  عدم استفاده از حلال‌های آلی خطرناک

✓  مناسب برای PCR، Sequencing و Cloning

✓  قابلیت تولید کیت‌های استاندارد

محدودیت‌های این روش :

✓ ظرفیت محدود ستون

✓ هزینه بالاتر نسبت به روش‌های سنتی

✓ نیاز به سانتریفیوژ با دور بالا

8-2 تخلیص پلاسمید با ذرات مغناطیسی (Magnetic Bead-Based Purification)

فناوری Magnetic Bead یکی از جدیدترین روش‌های استخراج DNA است که در بسیاری از سیستم‌های اتوماتیک آزمایشگاهی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

در این روش، DNA به سطح ذرات مغناطیسی پوشیده شده با مواد خاص متصل می‌شود.پس از اتصال DNA، با استفاده از میدان مغناطیسی، ذرات جدا می‌شوند سپس مراحل شستشو انجام شده وDNA   خالص آزاد می‌شود.

مزایای روش Magnetic Beads:

✓ امکان استخراج تعداد زیادی نمونه به صورت همزمان

✓ مناسب برای اتوماسیون

✓ کاهش خطای انسانی

✓ عدم نیاز به مراحل متعدد سانتریفیوژ

✓ سازگار با سیستم‌های High Throughput

این روش بیشتر در آزمایشگاه های تحقیقاتی بزرگ ، مراکز تولید کیت های تشخیص مولکولی ، بانک های DNA  و در مطالعات ژنومی ، کاربرد دارد.

8-3  سیستم‌های اتوماتیک استخراج پلاسمید

با افزایش نیاز به تولید پلاسمید در مقیاس بالا، سیستم‌های اتوماتیک توسعه یافته‌اند.

این سیستم‌ها قادرند صدها نمونه را همزمان پردازش کنند. حجم کار اپراتور و ظرفیت مورد نیاز برای استفاده از نیروی انسانی را کاهش داده و کیفیت خروجی را استاندارد کنند.

از این روش بیشتر در شرکت‌های تولیدکننده واکسن DNA ، مراکز تحقیقاتی دارویی ، تولیدکنندگان پروتئین نوترکیب و توسعه کیت‌های تشخیصی استفاده می شود.

9- انواع روش‌های استخراج پلاسمید بر اساس مقیاس تولید

روش استخراج پلاسمید بر اساس مقدار DNA مورد نیاز به چند گروه تقسیم می‌شود:

Mini-Prep.1-9

این روش رایج‌ترین روش برای بررسی اولیه کلون‌ها است.

این روش علاوه بر تسریع پروسه ی تخلیص پلاسمید ، بیشتر در حجم های پایین کشت باکتریایی و در موارد کم DNA  مورد استفاده قرار می گیرد .

رایج ترین موارد کاربردی این روش در بررسی حضور پلاسمید و Colony Screening است ، مقدار معمول DNA  در این روش حدود چند میکرولیتر یا کمتر ( بسته به نوع پلاسمید و سویه ی باکتری) می باشد.

Midi-Prep2-9

از این روش عمومن زمانی استفاده می‌شود که مقدار بیشتری DNA مورد نیاز است.

کاربردهای رایج از این روش بیشتر در Transfection اولیه ، مطالعات بیان ژن و آزمایش های محدود حیوانی است ، مهم ترین مزیت استفاده از این روش تعادل مناسب بین مقدار DNA ، زمان و هزینه ی صرف شده می باشد.

Maxi-Prep3-9

برای تولید مقادیر بالاتر پلاسمید از این روش استفاده می‌شود.کاربرد عمده ی این روش در Transfection گسترده تر ، مطالعات سلولی پیشرفته و تولید پلاسمید با خلوص بالا است . در این روش معمولاً کنترل کیفیت بیشتری انجام می‌شود.

 Mega-Prep4-9 و Giga-Prep

برای تولید مقادیر بسیار زیاد پلاسمید از این روش ها استفاده می شود ، کاربرد عمده ی این محصول در تولید صنعتی ، تولید مواد اولیه دارویی و تولید پلاسمیدهای مورد استفاده در Gene Therapy است.

جدول مقایسه روش‌های استخراج پلاسمید

روش	کاربرد اصلی	مقدار DNA	سطح خلوص مورد نیاز
Mini Prep	بررسی کلون	کم	متوسط
Midi Prep	تحقیقات مولکولی	متوسط	بالا
Maxi Prep	Transfection	زیاد	بسیار بالا
Mega/Giga Prep	تولید صنعتی	بسیار زیاد	بسیار بالا

10- ارزیابی کیفیت پلاسمید استخراج شده

پس از استخراج پلاسمید، ارزیابی کیفیت DNA یک مرحله ضروری است.

پارامترهای اصلی کنترل کیفیت عبارتند از:

10-1.  اندازه‌گیری غلظت DNA

روش‌های متداول:

اسپکتروفتومتری (Spectrophotometry) با اندازه‌گیری جذب در طول موج 260 نانومتر میزان تقریبی غلظت DNA تعیین می‌شود. در روش های تشخیص مولکولی برای بررسی میزان غلظت اسید نوکلئیک معمولن از دستگاه های بیوفوتومتر (Biophotometer) و در حال حاضر بیشتر از نانو دراپ (Nanodrop) استفاده می شود .

فلورومتری (Fluorometry)مانند Qubitهم روش دیگری است که نسبت به آلودگی‌ها حساسیت کمتری دارد و برای اندازه‌گیری دقیق‌تر DNA توصیه می‌شود.

10-2 . بررسی نسبت A260/A280

این نسبت نشان‌دهنده میزان خلوص DNA از نظر آلودگی پروتئینی است.

مقادیر مناسب برای DNA معمولاً حدود 1.8 تا 2.0 در نظر گرفته می‌شود. کاهش این مقدار می‌تواند نشان‌دهنده حضور پروتئین ، فنل و سایر ترکیبات آلی باشد.

10-3.  نسبت A260/A230

این شاخص برای بررسی آلودگی‌هایی مانند: نمک‌ها ، کربوهیدرات‌ها ، ترکیبات آلی و گوانیدین استفاده می‌شود.

مقدار مطلوب معمولاً می بایست حدود: 2.0 تا 2.2  باشد.

10-4. الکتروفورز ژل آگارز (Agarose Gel Electrophoresis)

این روش یکی از مهم‌ترین روش‌های بررسی ساختار پلاسمید است.پلاسمید معمولاً در سه فرم دیده می‌شود:

فرم Supercoiled: فرم طبیعی و فشرده پلاسمید است.

از ویژگی های این روش می توان به لود سریع ( حرکت سریع در ژل) و مناسب ترین فرم در بسیاری از کاربردها ، اشاره نمود.

فرم Open Circular (Nicked)

در اثر ایجاد شکست تک‌رشته‌ای ایجاد می‌شود.

از ویژگی های این روش می توان به لود آهسته ( حرکت آهسته تر ) و بررسی آسیب جزئی DNA  اشاره نمود.

فرم Linear

در اثر شکست دو رشته DNA ایجاد می‌شود.وجود مقدار زیاد این فرم می‌تواند نشان‌دهنده ی تخریب DNAو شرایط نامناسب استخراج می باشد.

11- کاربرد پلاسمید در تشخیص مولکولی و تولید کیت‌های PCR

با توسعه فناوری‌های تشخیص مولکولی، پلاسمیدها از یک ابزار صرفاً تحقیقاتی به یکی از اجزای مهم در طراحی، توسعه و اعتبارسنجی آزمون‌های تشخیصی تبدیل شده‌اند.

در بسیاری از آزمایشگاه‌های تشخیص مولکولی، شرکت‌های تولیدکننده ی کیت و مراکز تحقیقاتی، پلاسمیدهای مهندسی‌شده به عنوان مواد مرجع استاندارد مورد استفاده قرار می‌گیرند.

مهم‌ترین کاربردهای پلاسمید در حوزه تشخیص مولکولی عبارتند از:

11-1 . استفاده به عنوان کنترل مثبت (Positive Control)

یکی از مهم‌ترین کاربردهای پلاسمید در کیت‌های PCR و Real-Time PCR، استفاده به عنوان کنترل مثبت است.

کنترل مثبت وظیفه دارد نشان دهد که  آیا واکنش PCR به درستی انجام شده است Master Mix و آنزیم‌ها عملکرد مناسب دارند. پرایمرها و پروب‌ها قادر به شناسایی توالی هدف هستندو دستگاه Real-Time PCR قادر به تشخیص سیگنال فلورسانس است.

یک Positive Control پلاسمیدی استاندارد باید دارای ویژگی‌های زیر باشد:

✓ توالی هدف مشخص و تأیید شده باشد

✓ غلظت دقیق و قابل تکرار باشد

✓ پایداری مناسب با توجه شرایط نگهداری داشته باشد

✓ فاقد مواد مهارکننده PCR باشد

✓ قابلیت تولید در مقیاس بالا را داشته باشد.

11-2.  استفاده از پلاسمید به عنوان استاندارد کمی (Quantification Standard)

در آزمون‌های کمی Real-Time PCR، برای تعیین تعداد نسخه‌های DNA یا RNA هدف، نیاز به استانداردهای با غلظت مشخص وجود دارد.

پلاسمیدها به دلیل پایداری بالا، قابلیت تکثیر آسان و امکان تعیین دقیق تعداد کپی، به عنوان استانداردهای کمی استفاده می‌شوند.

معمولاً فرآیند شامل: تعیین غلظت DNA پلاسمیدی، محاسبه تعداد Copy Number، تهیه رقت‌های سریالی و ایجاد منحنی استاندارد (Standard Curve)است.

پارامترهایی مانند Efficiency PCR، R²و Slope برای ارزیابی عملکرد سیستم تشخیصی بررسی می‌شوند.

11-3.  نقش پلاسمید در توسعه و اعتبارسنجی کیت‌های Real-Time PCR

در فرآیند توسعه یک کیت مولکولی، پلاسمید می‌تواند در مراحل مختلف مورد استفاده قرار گیرد:

طراحی اولیه آزمون برای بررسی اختصاصیت پرایمرها (Specificity)، عملکرد پروب، محدوده تشخیص و تعیین

Limit of Detection (LOD) برای مشخص کردن پایین‌ترین مقدار قابل تشخیص توسط کیت، از رقت‌های متوالی پلاسمید استاندارد استفاده می‌شود.

مثلاً:

10⁶ Copy/µL

10⁵ Copy/µL

10⁴ Copy/µL

…

تا رسیدن به حد تشخیص نهایی.

بررسی Repeatability و Reproducibility

پلاسمید استاندارد در آزمایش‌های تکرارپذیری استفاده می‌شود تا مشخص شود عملکرد کیت:

در یک ران (Intra-assay) بین ران های مختلف (Inter-assay)چقدر پایدار است.

12-  اهمیت کیفیت پلاسمید در عملکرد کیت‌های مولکولی

کیفیت پایین پلاسمید مورد استفاده در توسعه یا تولید کیت می‌تواند باعث ایجاد مشکلات جدی شود.

 

برخی مشکلات رایج در خصوص کیفیت پایین پلاسمید :

12-1. کاهش حساسیت آزمون

وجود ناخالصی‌ها ممکن است باعث مهار Taq DNA Polymerase ،Reverse Transcriptase وآنزیم‌های اصلاح ژنتیکی

شود. نتیجه ی این رویداد می تواند موجب افزایش Ct در Real-Time PCR، کاهش Signal Intensity و ایجاد نتایج False Negative شود.

12-2. تغییر در مقدار واقعی Copy Number

اگر غلظت پلاسمید به صورت دقیق تعیین نشود، استانداردهای کمی اشتباه خواهند بود.

این موضوع در آزمون هایی مانند Quantitative PCR(Viral Load) و Microbial Load Detection اهمیت مضاعفی دارد.

12-3  کاهش پایداری کنترل مثبت

یک کنترل مثبت نامناسب ممکن است در طول زمان دچار تخریب شود و در نتیجه افت عملکرد ، نتایج آزمون ها را تحت تأثیر قرار دهد. به همین دلیل در تولید کیت‌های تجاری، بررسی پایداری (Stability Study) ضروری است.

13-  عوامل مؤثر بر کیفیت و بازده استخراج پلاسمید 

بازده و کیفیت پلاسمید استخراج شده تحت تأثیر عوامل مختلفی قرار دارد:

13-1  نوع سویه باکتریایی

سویه میزبان نقش مهمی در میزان تولید پلاسمید دارد.

ویژگی‌های مطلوب سویه ی انتخابی مشتمل بر رشد سریع ، پایداری پلاسمید و حداقل تولید نوکلئاز است .

سویه‌های رایج:

1. coli DH5α
2. coli TOP10
3. coli Stbl3

13-2. اندازه پلاسمید

اندازه پلاسمید بر سرعت تکثیر ، پایداری و بازده استخراج تأثیر مستقیم دارد.

پلاسمیدهای کوچک معمولاً تعداد کپی بیشتری داشته و بازده مناسب تری ایجاد می‌کنند.

پلاسمیدهای بزرگ حساس‌تر هستند و نیاز به شرایط استخراج دقیق تری دارند.

13-3. تعداد کپی پلاسمید (Copy Number)

پلاسمیدها بر اساس تعداد نسخه در سلول به دو گروه اصلی تقسیم می‌شوند:

High Copy Plasmids:

از ویژگی های این گروه تعداد نسخه ی زیاد، استخراج آسان‌تر و مناسب تر بودن برای تولید DNA زیاد می باشد .

Low Copy Plasmids:

ویژگی های این گروه مشتمل بر تعداد نسخه ی کمتر، پایداری بالاتر برای برخی ژن‌های حساس می باشد.

13-4 شرایط کشت باکتری

از پارامترهای مهم در کشت بهینه ی باکتری می توان به کیفیت محیط کشت، زمان رشد، دمای مناسب انکوباسیون، غلظت آنتی‌بیوتیک اشاره نمود .

کشت طولانی مدت می تواند موجب افزایش DNA کروموزومی، کاهش کیفیت پلاسمید و افزایش آلودگی‌ها شود.

13-5 کیفیت مراحل لیز و Neutralization

یکی از حساس‌ترین مراحل استخراج پلاسمید، کنترل دقیق فرآیند لیز است. لیز بیش از حد باعث آزاد شدن DNA ژنومی، افزایش ویسکوزیته ی نمونه و کاهش خلوص پلاسمید می‌شود و لیز ناکافی و ضعیف هم در مقابل می تواند موجب کاهش بازده استخراج و باقی ماندن پلاسمید داخل سلول گردد.

14- مشکلات رایج در استخراج پلاسمید و راهکارهای رفع آن

1: بازده پایین DNA

از علل احتمالی این پیشامد می توان به تعداد کم سلول‌های باکتریایی، پلاسمید Low Copy، رشد نامناسب در پروسه ی کشت و تخریب DNAباشد.

جهت ممانعت از این اتفاق می توان مواردی همچون بررسی سویه میزبان، بهینه‌سازی شرایط کشت و استفاده از روش مناسب Scale-up را مورد نظر قرار داد.

2: آلودگی RNA

علت آلودگی می تواند ناشی از عملکرد ضعیف RNase باشد و جهت پیشگیری از این رخداد، می توان از RNase  مناسب و فعال که در شرایط مناسب نگهداری شده است، استفاده نمود.

3: وجود DNA ژنومی

از علل وجود DNA  ژنومی می توان به لیز شدید و نامتعارف و مخلوط کردن ( Vortex) بیش از حد  نمونه پس از افزودن محلول SDS/NaOH اشاره نمود. با انجام پروسه ی Mix به صورت آرام و کنترل زمان انجام این پروسه، می توان از این پیشامد، ممانعت کرد.

4: عملکرد ضعیف در PCR

از دلایل عملکرد نامناسب در پروسه ی PCR می توان به باقی ماندن اتانول، نمک‌های باقیمانده و غلظت بیش از حد DNAاشاره نمود. خشک نمودن کامل ستون قبل از Elution و انجام Purification مجدد در صورت نیاز می تواند به حل این مشکل، کمک نماید.

15- فناوری‌های آینده در استخراج و تخلیص پلاسمید

با رشد سریع فناوری‌های حوزه ی زیست‌فناوری، نیاز به تولید پلاسمیدهای با کیفیت بالاتر، خلوص بیشتر و قابلیت استفاده در کاربردهای بالینی افزایش یافته است. روش‌های سنتی استخراج پلاسمید به سمت سیستم‌های سریع‌تر، اتوماتیک‌تر و استانداردتر حرکت کرده‌اند.

مهم‌ترین روندهای آینده در این حوزه عبارتند از:

 

15-1.  اتوماسیون کامل فرآیند استخراج پلاسمید

یکی از مهم‌ترین مسیرهای توسعه، استفاده از سیستم‌های کاملاً اتوماتیک است که موجب کاهش خطای انسانی ، افزایش تکرارپذیری، امکان پردازش تعداد زیاد نمونه و استانداردسازی کیفیت محصول نهایی را به همراه دارد.

این فناوری به‌خصوص در شرکت‌های تولیدکننده کیت‌های تشخیصی، مراکز تحقیقاتی بزرگ و تولیدکنندگان محصولات بیولوژیک اهمیت زیادی دارد.

15-2.  فناوری Magnetic Bead نسل جدید

ذرات مغناطیسی به دلیل قابلیت سازگاری با سیستم‌های اتوماتیک، نقش مهمی در آینده استخراج DNA خواهند داشت.

از مزایای این فناوری می توان به عدم نیاز به ستون‌های یک‌بار مصرف، کاهش مصرف مواد مصرفی، سرعت بالاتر و امکان Miniaturization اشاره نمود .

این فناوری در حال تبدیل شدن به یکی از روش‌های استاندارد در آزمایشگاه‌های High Throughput است.

15-3. پلاسمیدهای با گرید دارویی (GMP Grade Plasmid DNA)

با گسترش کاربردهایی مانند ژن‌تراپی (Gene Therapy)واکسن‌های بر پایه ی  DNA، درمان‌های مبتنی بر RNAو سلول‌درمانی نیاز به پلاسمیدهایی با استانداردهای دارویی افزایش یافته است.

پلاسمیدهای مورد استفاده در کاربردهای بالینی می بایست دارای خلوص بالا بوده و فاقد اندوتوکسین باشند. ساختار صحیح خود را حفظ کرده و تحت شرایط GMP تولید شوند.

15-4. نقش پلاسمید در نسل جدید تشخیص مولکولی

با توسعه تکنیک‌هایی مانند:

Digital PCR

Multiplex Real-Time PCR

Next Generation Sequencing

CRISPR-Based Diagnostics

نیاز به کنترل‌های مولکولی دقیق‌تر افزایش یافته است.

پلاسمیدهای استاندارد شده می‌توانند به عنوان کنترل مثبت چندگانه (Multiplex Positive Control)، استاندارد کمی دقیق

و مواد مرجع آزمایشگاهی استفاده شوند.

16- کنترل کیفیت پلاسمید استخراج شده (Plasmid Quality Control)

برای اطمینان از مناسب بودن پلاسمید برای کاربردهای تحقیقاتی یا تشخیصی، مجموعه‌ای از آزمون‌های کنترل کیفیت انجام می‌شود.

16-1.  بررسی غلظت DNA

روش‌های رایج:

Nanodrop Spectrophotometer

مزایای استفاده از این روش سریع بودن و عدم نیاز به مواد مصرفی زیاد است اما محدودیت این روش، حساسیت به ناخالصی ها است.

Qubit Fluorometer

مزایای استفاده از این روش، دقت بالاتر و اختصاصیت بیشتر برای DNA دو رشته‌ای است .

16-2.  بررسی ساختار پلاسمید

با استفاده از Agarose Gel Electrophoresis  و Restriction Enzyme Digestion میتوان اندازه و وضعیت ساختاری DNA  مورد نظر را ارزیابی نمود.

16-3.  تأیید توالی (Sequence Verification)

Sequence Verification در مصارف حساس، به‌ ویژه برای تولید کیت، کنترل‌های PCR، کاربردهای بالینی و تأیید توالی پلاسمید ضروری است.

روش رایج در انجام این پروسه، روش Sanger Sequencing است که امکان بررسی، توالی Insert، محل اتصال‌ها و عدم وجود جهش (( Mutation  را فراهم می نماید.

16-4.  بررسی میزان اندوتوکسین

برای کاربردهای سلولی و درمانی، میزان اندوتوکسین باید کنترل شود. آزمون رایج برای این بررسی LAL Test (Limulus Amebocyte Lysate) است. مقادیر بالای اندوتوکسین می‌تواند باعث سمیت سلولی، تحریک پاسخ ایمنی و کاهش بیان ژن شود.

•  جمع‌بندی نهایی

استخراج و تخلیص پلاسمید یکی از پایه‌ای‌ترین و در عین حال حیاتی‌ترین فرآیندها در زیست‌شناسی مولکولی مدرن است.

از تحقیقات پایه در مهندسی ژنتیک تا توسعه کیت‌های تشخیصی، تولید پروتئین‌های نوترکیب، واکسن‌های DNA و درمان‌های ژنی، پلاسمیدها نقش محوری دارند.

انتخاب روش مناسب استخراج، توجه به کیفیت مواد اولیه، کنترل دقیق مراحل لیز و تخلیص و انجام آزمون‌های کنترل کیفیت، عوامل تعیین‌کننده در دستیابی به پلاسمید با کیفیت بالا هستند.

در حوزه تشخیص مولکولی، یک پلاسمید استاندارد و با کیفیت می‌تواند نقش مهمی در افزایش اطمینان‌پذیری نتایج PCR، کاهش خطاهای آزمایشگاهی و توسعه محصولات تشخیصی دقیق‌تر داشته باشد.

با حرکت فناوری به سمت اتوماسیون، تولید پلاسمیدهای گرید بالینی و کاربردهای درمانی، اهمیت این مولکول کوچک DNA در آینده زیست‌فناوری بیش از پیش افزایش خواهد یافت.

راهکارهای تخصصی شرکت درمان نگار آیندگان در حوزه استخراج و تخلیص پلاسمید

امروزه کیفیت استخراج و تخلیص پلاسمید، یکی از عوامل تعیین‌کننده در موفقیت آزمایش‌های زیست‌شناسی مولکولی، توسعه کیت‌های تشخیصی، تولید پروتئین‌های نوترکیب و مطالعات مهندسی ژنتیک محسوب می‌شود. انتخاب تجهیزات مناسب، کیت‌های استاندارد و به‌کارگیری روش‌های به‌روز، نقش مهمی در دستیابی به نتایج دقیق، تکرارپذیر و قابل اعتماد دارد.

شرکت درمان نگار آیندگان (DNA) با تمرکز بر ارائه راهکارهای نوین در حوزه تشخیص مولکولی و فناوری‌های زیستی، تلاش می‌کند نیازهای آزمایشگاه‌های تشخیص پزشکی، مراکز تحقیقاتی، دانشگاه‌ها و شرکت‌های فعال در حوزه بیوتکنولوژی را با ارائه محصولات و خدمات تخصصی برآورده سازد.

دامنه فعالیت‌های این شرکت شامل تأمین تجهیزات آزمایشگاهی، سیستم‌های استخراج اسیدهای نوکلئیک، دستگاه‌های Real-Time PCR، تجهیزات اتوماسیون آزمایشگاهی و ارائه پشتیبانی علمی و فنی است. هدف این مجموعه، فراهم کردن راهکارهایی است که علاوه بر ارتقای کیفیت نتایج آزمایشگاهی، موجب افزایش بهره‌وری و اطمینان در فرآیندهای تشخیصی و تحقیقاتی شود.

درباره این مقاله

این مقاله بر اساس منابع علمی معتبر، کتاب‌های مرجع زیست‌شناسی مولکولی و مستندات فنی شرکت‌های پیشرو در حوزه بیوتکنولوژی تدوین شده و تلاش شده است جدیدترین مفاهیم و فناوری‌های مرتبط با استخراج و تخلیص پلاسمید به زبانی علمی، روان و کاربردی ارائه شود.

•  منابع علمی و مطالعات پیشنهادی

1.Birnboim HC, Doly J.

A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.

Nucleic Acids Research. 1979;7(6):1513–1523.

https://doi.org/10.1093/nar/7.6.1513

2.Sambrook J, Russell DW.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3.Green MR, Sambrook J.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition.

 

4.Ausubel FM et al.

Current Protocols in Molecular Biology.

 

5.Brown TA.

Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction.

 

6.QIAGEN.

Plasmid Purification Handbook.

QIAGEN Molecular Biology Resources⁠

7.Thermo Fisher Scientific.

Plasmid DNA Purification Resources.

Thermo Fisher Scientific Molecular Biology Resources⁠

8.Promega Corporation.

Plasmid DNA Purification Technical Resources.

Promega Molecular Biology Resources⁠