نوشته‌ها

روش های استخراج اسید نوکلئیک

برای استخراج اسید نوکلئیک ۳ بخش اصلی داریم:

در مرحله اول باید غشای سلولی شکسته شود  که محتویات درون سلول آزاد شود که اصطلاحا لیز سلولی میگویند.

در مرحله دوم DNA  را از مواد و مولکولی که منجر به آلودگی آن میشود جدا می کنیم برای این کار دو فاز ایجاد می شود که DNA  در یک فتز قرار می گیرند و آلودگی ها در فاز دیگر قرار می گیرند.

در مرحله سوم برای استخراج، DNA   را از محلول جدا یا ته نشین می کنند.

  • استخراج به روش Phenol chloroform :

این روش در سال ۱۹۶۰ ابداع شد. در این روش در مرحله اول لایز بافر را به محلول مورد نظر اضلفه می کنیم سپس آنزیم RNase A یا Proteinase K را برای حذف آلودگی ها به محلول لایز اضافه می کنیم.

در مرحله دوم برای پاکسازی باقی مانده آلودگی ها محلول فنول کلروفورم را به بافر اضافه می کنیم سپس محلول را سانتریفیوژ می کنیم. فاز پایینی محلول فنول قرار دارد که غیر قطبی است و لیپید ها در آن قرار می گیرند. فاز میانی کلروفورم است که پروتئین ها در آن فاز قرار می گیرند. فاز بالایی ، فاز بافر است که DNA  در آن قرار می گیرد.

در مرحله سوم DNA را رسوب می کنیم برای رسوب از اتانول و سدیم استات استفاده می کنیم که باعث می شود DNA حلالیت خود را در آب از دست بدهد و رسوب کند در این مرحله نیز سانتریفیوژ انجام می شود  و DNA در ته تیوب قرار می گیرد.

از مزایای این روش ارزان بودن آن است و از معایب آن سمی و خورنده بودن فنول است.

  • استخراج به روش salting out :

این روش نیز از ۳ بخش اصلی برای استخراج DNA استفاده می شود پس از اضافه کردن لایز بافر با اضافه کردن Nacl با غلظت بالا بعد از سانتریفیوژ پروتئین ها در انتهای تیوب قرار می گیرند و DNA در فاز بالایی قرار خواهد گرفت. مبنای روش salting out حذف پروتئین ها می باشد به طوری که با افزایش غلظت نمک با توجه به بار پروتئین حلالیت آن کاهش می یابد. در مرحله ریکاوری با اضافه کردن اتانول ۱۰۰ درصد بعد از سانتریفیوژ DNA رسوب خواهد کرد.

  • استخراج به روش Spin column-based DNA purification :

در این روش محتوای سلول به سلیکا ژل می چسبد پس از اضافه کردن لایز بافر و بایندینگ بافر ،ستون را چند بار با washing شستشو می دهیم سپس با اضافه کردن Eloution  ، DNA از سلیکا ژل جدا خواهد شد.

 

 

تهران بلوار جلال آل احمد ، بین امیر آباد شمالی و اتوبان چمران، خیابان پروانه،نبش کوچه چهارم،پلاک۷

۰۲۱۸۸۶۳۳۷۰۵

Info@darmannegar.com