دیجیتال PCR
Digital PCR
در روش Digital PCR، دستگاه PCR واکنشی که میان الگوی نوکلئیک اسید ها، پرایمر ها، پروب ها، آنزیم ها و بافر ها قرار است رخ دهد را به هزاران ریزواکنش کوچک تقسیم میکند. هر بخش ممکن است شامل هیچ، یک یا چندین نوکلئیک اسید مورد نظر یا هدف باشند. دستگاه Digital PCR هر ریزواکنش را جداگانه انجام میدهد و در انتها با استفاده از پروب های فلورسنت وجود یا عدم وجود تکثیر را در هر بخش مشخص میکند، ریزواکنش های مثبت، بخش هایی هستند که نوکلئیک اسید های هدف در آنها تکثیر شده و امواج فلورسنت ساطع نموده و ریزواکنش های منفی، بخش هایی اند که نوکلئیک اسید های هدف در آنها حضور نداشته و تکثیری رخ نداده است
واژه ی دیجیتال در Digital PCR به این دلیل به کار میرود که محاسبات دستگاه بر اساس صفر و یک هایی خواهد بود که از هر بخش که به دلیل حضور یا عدم حضور نوکلئیک اسید هدف بدست آمده، انجام میشود، مزیت این روش در این نکته نهفته است که به جای مواجه شدن با طیف زیادی از محتملات، دستگاه کافی است تمایز میان دو سیگنال یعنی بخش های مثبت و منفی را دریافت و تحلیل نماید. بعد از آنالیز کردن تعداد ریزواکنش های مثبت و منفی، مقدار دقیق مولکول های موجود در نمونه با استفاده از قانون پواسون مشخص میگردد. برخلاف تکنیک qPCR، در روش Digital PCR تنها به منحنی استاندارد تکیه نمیشود. دقت این روش اجازه میدهد تکثیرهای نادری که ممکن است در حین واکنش رخ دهند نیز بهتر مشخص گردند
قانون پواسون در Digital PCR
در روشDigital PCR از مدل پواسون برای محاسبه ی تعداد تکثیر سلول ها در هر بخش استفاده میشود. این روال بر اساس احتمال حضور صفر، یک، دو، سه، چهار یا پنج سلول هدف در هر ریز واکنش در زمان پارتیشنینگ عمل میکند.
همان طور که در تصویر 2 مشاهده میشود در غلظتی برابر با 0.1 اکثر بخش ها دارای مقدار صفر کپی از مولکول هدف هستند و بخش های مثبت تقریبا دارای یک کپی از مولکول هدف، هر چه مقدار غلظت نمونه ی ما افزایش میابد تا مثلا 5 لاندا، اکثر بخش ها دارای حداقل یک کپی از نمونه ی هدف هستند و تقریبا هیچ بخشی بدون کپی از مولکول هدف باقی نمانده است. حال به عنوان مثال اگر ما مقدار 5 میکرولیتر از نمونه را با مقدار 3 میکرولیتر از مسترمیکس و 4 میکرولیتر از پرایمر مخلوط کنیم که حجم نهایی به مقدار 12 میکرولیتر برسد، پس از اجرای فرایند Digital PCR به عنوان مثال ما 4000 بخش مثبت از مقدار مجموع 8000 بخش خواهیم داشت، مقدار نهایی مولکول های هدف کپی شده با ضرب کردن مقدار مولکول های کپی شده در هر بخش به تمام بخش های مثبت موجود بدست خواهد آمد و با دانستن مقدار مولکول های کپی شده ی هر بخش و حجم هر بخش میتوانیم مقدار هر کپی در میکرولیتر را محاسبه نماییم
همان طور که در تصویر 3 مشاهده میشود، با محاسبه ی لوگاریتم طبیعی تعداد تمام بخش ها منهای بخش های مثبت بر مقدار تمام بخش ها، تعداد تکثیر سلول ها در هر بخش مشخص میگردد که با تقسیم این تعداد بر مقدار حجم هر بخش، مقدار نهایی مولکول های کپی شده برابر با 3013 کپی در هر میکرولیتر است که با توجه به آنکه حجم نمونه ی ما مقدار 12 میکرولیتر بوده است، مقدار نهایی مولکول های کپی شده برابر با 12 × 3013 خواهد بود یعنی عدد 36156 کپی.
کاربرد های Digital PCR
توانایی این روش در کمی سازی مقدار دقیق DNA، cDNA و RNA و تشخیص حضور(مثبت) یا عدم حضور(منفی) مولکول هدف در نتیجه ی نهایی واکنش بسیار پرکاربرد و مفید است. به دلیل اینکه آنالیز در این روش در انتهای فرایند بدون تکیه به منحنی های استاندارد صورت میپذیرد، نتیجه بسیار دقیق است و کمتر تحت تأثیر موانعی مثل Inhibitors و Amplifications Biases قرار میگیرد. بر خلاف روش های دیگر Realtime-PCR استفاده از این روش زمانی که با حجم های بسیار کم یا ژنها و یا جهشهای نادر در نمونههای پیچیده مواجهیم بسیار موثر تر و دقیق تر است.
از سری کاربرد های تکنیک Digital PCR میتوان به موارد زیر اشاره کرد:
- تشخیص توالی های نادر
- آنالیز تنوع تعداد کپی (CNV)
- کمی سازی جهش های نادر از جمله در Liquid Biopsy Testing
- Single Cell Analysis
- بیان ژن و آنالیز miRNA
- تشخیص پاتوژنها
- کنترل کیفی NGS Libraries
- تشخیص هدف های نادر از نمونه های محیطی مانند Wastewater و Sewage
روش Droplet Digital PCR (ddPCR) برای پارتیشنینگ نمونه
در این روش نیز مانند روش Real-Time PCR به آماده سازی نمونه برای واکنش نیاز داریم که شامل نمونه با غلظت کافی، پروب، مسترمیکس و پرایمر میباشد. برای داشتن بهترین بازده، حداقل مقدار 20 میکرولیتر از نمونه ی آماده سازی شده به چاهک کارتریج دستگاه اضافه میشود، سپس دستگاه با تکنولوژی Microfluidics، فاز آبی (نمونه) را با استفاده از فشار روغن در کپیلاری به هزاران قطره ی کوچک با حجم تقریبا 1 نانولیتر تقسیم میکند. در این فرایند در هر قطره ممکن هست هیچ، یک یا تعداد بیشتری از مولکول های هدف وجود داشته باشد. پس از انجام فرایند پارتیشنینگ، نمونه میتواند مرحلهی تکثیر را پشت سر بگذارد.
تفاوت dPCR با Real-Time PCR
از تفاوت های اصلی میان این روش با روش Real-Time PCR میتوان به تفاوت در اندازه گیری مقدار PCR Product اشاره کرد. در روش Real-Time PCR مقدار نمونه تکثیر شده با استفاده از منحنی های استاندارد به دست می آید و در هر سیکل مقدار تکثیر نمونه مشخص میگردد در حالیکه در روش dPCR، نمونه به هزاران قطره تقسیم شده و پس از فرایند تکثیر، اطلاعات هر بخش در انتهای فرایند با استفاده از قانون پواسون آنالیز شده و تعداد نهایی مولکول ها مشخص میگردد. دقت در فرایندDigital PCR نسبت به روش Real-Time PCR بسیار بالاتر است. روش دیجیتال حساسیت کمتری نسبت به Inhibitor ها دارد زیرا نمونه به هزاران قطره ی نانولیتری تقسیم شده و واکنش در هر قطره به صورت مجزا انجام میپذیرد. به دلیل پارتیشن بندی نمونه روش دیجیتال، دقیقتر و دارای Runtime طولانی تری نسبت به روش Real-Time PCR است. البته باید تاکید کرد که دقت بالای این تکنیک نیز محصول Partitioning و اجرای واکنش در Dropletهاست.
کارایی Digital PCR و Real-Time PCR در تشخیص سرطان
در بین تکنیکهای تشخیص سرطان یا بررسی های دقیق ویروسی، گاهی یک سلول جهش یافته (Mutant) در میان 10000 سلول سالم (Wild-Type) پنهان شده است که در فرایند Real-Time PCR، پرایمر ها و dNTP ها به دلیل کثرت سلول های سالم، بیشتر به Wild-Typeها تکثیر شده و در فرآیند رقابتی PCR نوع Mutant شانس کمتری برای تکثیر خواهد داشت و عموما در این رقابت بازنده خواهد بود. این موضوع باعث میشود که Mutantها مثلا در سیکل های 5 یا 10 اصطلاحا گرسنه بمانند و از فرایند تکثیر عملا خارج شوند. وقتی نسبت Mutant کمتر از 5% تمام خروجی تکثیر شده (Wild-Type و Mutant) باشد، شدت سیگنال فلورسنت حاصل از تکثیر Mutant به نسبت شدت سیگنال Wild-Type بسیار کمتر خواهد بود. در چنین شرایطی ممکن است به دلیل خطای اپتیکی و هم پوشانی رنگ ها حتی نور ساطع شده از تکثیر Wild-Type وارد کانال رنگی Mutant شود. در این صورت حتی ممکن است نمودار تکثیر Mutant به صورت یک خط مورب ضعیف بالا برود که موجب عدم قطعیت در آنالیز نمودار تکثیر خواهد شد.
خطای دیگر در روش Real-Time PCR این است که وقتی سیگنال فلورسنت حاصل از تکثیر Mutant ضعیف باشد و به خط آستانه یا Threshold نرسد و یا در سیکلهای بالاتر مثلا سیکل 40 ام به خط آستانه برسد، نرمافزار آنالیز آن را به عنوان Non-Specific Amplification دسته بندی میکند و پاسخ مثبت را گزارش نمیکند و نتیجه آنالیز نمونه منفی کاذب خواهد بود.
با توجه به مشکلات فوق، روش Digital PCR با استفاده از Partitioning و تقسیم یک واکنش PCR به تعداد زیادی ریزواکنش و فراهم آوردن شانس برابر تر در رقابت واکنشی PCR بین Mutant و Wild-Type احتمال عدم و یا کاهش شدید تکثیر Mutant را در مقایسه با Wild-Type از بین برده و دقت تشخیص Mutant را حتی با Load بسیار کم در نمونههای حساس بالا خواهد برد.
