1.کشت سلولی چیست؟ 

سلول بنیادی‌ترین واحد ساختاری و عملکردی موجودات زنده است و تقریباً تمام فرآیندهای حیاتی، از تولید انرژی و ساخت پروتئین گرفته تا تقسیم سلولی، ارتباط بین سلولی و پاسخ به عوامل محیطی، در سطح سلول یا تحت کنترل مستقیم آن اتفاق می‌افتند.

برای مطالعه این فرآیندها، دانشمندان نیاز دارند سلول را در شرایطی کنترل‌شده مشاهده و بررسی کنند. در بدن موجود زنده، سلول‌ها تحت تأثیر مجموعه بسیار پیچیده‌ای از عوامل قرار دارند؛ از جمله سلول‌های مجاور، هورمون‌ها، فاکتورهای رشد، مواد غذایی، اکسیژن، ماتریکس خارج سلولی و سیستم ایمنی.

کشت سلولی این امکان را فراهم می‌کند که سلول‌ها خارج از بدن و در یک محیط آزمایشگاهی کنترل‌شده رشد داده و مطالعه شوند.

به بیان ساده، کشت سلولی مجموعه‌ای از روش‌هاست که امکان حفظ حیات، رشد، تکثیر و در برخی موارد تمایز و انجام عملکرد اختصاصی سلول‌ها در شرایط In Vitro را فراهم می‌کند.

اما این تعریف ساده نباید باعث شود کشت سلولی را یک تکنیک ابتدایی تصور کنیم. امروزه کشت سلولی یک فناوری بسیار گسترده است که از یک آزمایش ساده در یک فلاسک شروع می‌شود و تا تولید صنعتی آنتی‌بادی‌های مونوکلونال، واکسن‌ها، پروتئین‌های نوترکیب و برخی محصولات پیشرفته سلولی ادامه پیدا می‌کند.

۱-۱. In Vitro یعنی چه؟

یکی از اولین مفاهیمی که هنگام ورود به حوزه کشت سلولی باید با آن آشنا شویم، اصطلاح In Vitro است.

In Vitro  به مطالعه یا انجام یک فرآیند زیستی خارج از بدن موجود زنده و در محیط آزمایشگاهی گفته می‌شود.

در مقابل، سه اصطلاح دیگر نیز بسیار مورد استفاده قرار می‌گیرند:

In Vivo:

مطالعه فرآیند در داخل موجود زنده.

Ex Vivo:

بررسی سلول یا بافتی که از موجود زنده خارج شده، در شرایطی که برای مدت محدودی ویژگی‌های طبیعی خود را حفظ می‌کند.

۱-۲. چرا نمی‌توان سلول را در هر محیطی رشد داد؟

سلول برای زنده ماندن فقط به آب و مواد غذایی نیاز ندارد.

در بدن، سلول در یک محیط بسیار دقیق تنظیم‌شده زندگی می‌کند.

این محیط باید از نظر عواملی مانند:

دما، PH، اسمولاریته، اکسیژن، مواد غذایی، یون‌ها، فاکتورهای رشد، هورمون‌ها و ارتباط با سلول‌های دیگر در محدوده مناسبی قرار داشته باشد.

هنگامی که سلول را از بدن خارج می‌کنیم، بسیاری از این شرایط از بین می‌روند.

بنابراین هدف اصلی محیط کشت این است که تا حد امکان شرایط لازم برای ادامه حیات و عملکرد سلول را فراهم کند.

۱-۳. محیط کشت سلولی چیست؟

محیط کشت سلولی، محیطی است که مواد مورد نیاز سلول برای رشد و متابولیسم را فراهم می‌کند.

یک محیط کشت معمولاً حاوی ترکیبی از:

آب، نمک‌ها، آمینواسیدها، ویتامین‌ها، منابع انرژی، مواد بافر و در برخی موارد فاکتورهای رشد است.

نوع محیط کشت باید بر اساس نوع سلول انتخاب شود.

برای مثال، محیط مناسب برای یک Fibroblast الزاماً بهترین محیط برای یک Neuron یا Stem Cell نیست.

به همین دلیل یکی از اولین مهارت‌های یک کارشناس کشت سلولی، شناخت نیازهای سلول مورد استفاده است.

2. انواع کشت سلولی و مدل‌های مورد استفاده در آزمایشگاه

2-1. سلول‌های Adherent ( چسبنده) و Suspension (معلق)

یکی از اولین تقسیم‌بندی‌های مهم کشت سلول بر اساس نحوه رشد سلول است.

برخی سلول‌ها برای رشد به یک سطح نیاز دارند. این سلول‌ها را سلول های چسبنده  می‌نامیم.

این سلول‌ها روی سطح  فلاسک ، پلیت  یا ظروف مخصوص می‌چسبند و تکثیر می‌شوند.

در مقابل، برخی سلول‌ها به‌صورت آزاد در محیط رشد می‌کنند و نیاز به اتصال به سطح ندارند. این سلول‌ها ، سلول های معلق

نامیده می‌شوند.

این تفاوت از نظر نحوه نگهداری، پاساژ سلولی، شمارش و طراحی سیستم کشت بسیار مهم است.

2-2. Primary Cell و Cell Line

تقسیم‌بندی مهم دیگر بر اساس منشأ سلول است.

Primary Cell

سلول‌هایی هستند که مستقیماً از یک بافت یا نمونه زیستی جدا شده‌اند.این سلول‌ها معمولاً شباهت بیشتری به سلول‌های طبیعی بدن دارند، اما اغلب ظرفیت تکثیر محدودی دارند و نگهداری آن‌ها نسبت به Cell Line دشوارتر است.

Cell Line

جمعیتی از سلول‌هاست که پس از جداسازی و کشت، قابلیت رشد و تکثیر در شرایط آزمایشگاهی را پیدا کرده است.

برخی Cell Lineها طول عمر محدودی دارند و برخی دیگر می‌توانند برای مدت بسیار طولانی تکثیر شوند.

2-3. چرا Cell Lineها در تحقیقات اهمیت دارند؟

فرض کنید یک پژوهشگر بخواهد اثر یک دارو را روی یک نوع سلول بررسی کند.

اگر برای هر آزمایش مجبور باشد سلول را از یک نمونه جدید تهیه کند، تفاوت‌های زیستی بین نمونه‌ها می‌تواند نتایج را تحت تأثیر قرار دهد.

استفاده از یک رده ی سلولی مشخص، در بسیاری از مطالعات امکان ایجاد یک سیستم آزمایشی نسبتاً استاندارد و قابل تکرار را فراهم می‌کند.

البته این موضوع به معنای یکسان بودن کامل رفتار رده ی سلولی با سلول طبیعی نیست.

Cell Line  ممکن است در طول زمان و در اثر پاساژ سلول های متعدد دچار تغییرات فنوتیپی یا ژنتیکی شود.

بنابراین Cell Authentication و کنترل Passage Number اهمیت زیادی دارد.

2-4. کاربردهای اصلی کشت سلولی

امروزه کاربرد کشت سلولی بسیار گسترده است.

در تحقیقات پایه می‌توان از آن برای مطالعه:

Cell Cycle ،Apoptosis ،Differentiation ،Gene Expression و Signal Transduction استفاده کرد.

در تحقیقات پزشکی، کشت سلولی برای مدل‌سازی بیماری‌ها و بررسی پاسخ سلول به درمان کاربرد دارد.

در صنعت دارویی نیز از کشت سلولی برای غربالگری داروها ، بررسی سمیت، تولید پروتئین‌های نوترکیب، تولید آنتی‌بادی و تولید برخی واکسن‌ها استفاده می‌شود.

در پزشکی بازساختی نیز سلول‌های بنیادی و سایر Cell-based Systems اهمیت فزاینده‌ای پیدا کرده‌اند.

2-5. محدودیت مهم کشت سلولی

یکی از مهم‌ترین اشتباهات در تفسیر نتایج کشت سلولی این است که تصور کنیم سلول در فلاسک دقیقاً همان رفتاری را دارد که در بدن دارد. در بدن، سلول در یک Microenvironment پیچیده قرار دارد.

سلول با سلول‌های مجاور، Extracellular Matrix، هورمون‌ها، فاکتورهای رشد، سیستم ایمنی و جریان خون تعامل دارد.

اما در یک کشت دوبعدی ساده، بسیاری از این عوامل وجود ندارند.

به همین دلیل، نتیجه یک آزمایش کشت سلولی باید در چارچوب محدودیت‌های مدل تفسیر شود.

این موضوع یکی از دلایل توسعه مدل‌های 3D Culture، Spheroid و Organoid بوده است.

2-6. چرا Aseptic Technique اهمیت دارد؟

یکی از بزرگ‌ترین چالش‌های کشت سلولی، آلودگی است.

سلول‌های کشت‌شده در محیطی سرشار از مواد غذایی قرار دارند و همین محیط می‌تواند برای رشد میکروارگانیسم ها نیز مناسب باشد.

آلودگی با باکتری، قارچ، مخمر و مایکوپلاسما می‌تواند رشد سلول، متابولیسم، بیان ژن و حتی نتیجه آزمایش‌های مولکولی را تغییر دهد. به همین دلیل، Aseptic Technique یکی از پایه‌ای‌ترین مهارت‌های کشت سلولی است.

2-7. از یک فلاسک تا Bioreactor

کشت سلولی می‌تواند در مقیاس‌های بسیار متفاوت انجام شود.

در آزمایشگاه تحقیقاتی ممکن است سلول‌ها در یک T-Flask کشت شوند.

در مطالعات با حجم بیشتر، از Culture Plate، Multi-layer Vessel یا Spinner System استفاده می‌شود.

در تولید صنعتی، سلول‌ها می‌توانند در Bioreactorرشد کنند.

بنابراین اصول بنیادی کشت سلولی در مقیاس‌های مختلف ثابت می‌ماند، اما با افزایش مقیاس، کنترل پارامترهایی مانند Oxygen Transfer، Mixing، pH و Nutrient Supply اهمیت بسیار بیشتری پیدا می‌کند.

2-8. آینده کشت سلولی

کشت سلولی دیگر محدود به رشد سلول روی یک سطح پلاستیکی نیست.

امروزه فناوری‌هایی مانند 3D Cell Culture ،Organoid  Organ-on-a-Chip ،Stem Cell Culture و Automated Cell Culture در حال توسعه هستند.

این فناوری‌ها تلاش می‌کنند محیط آزمایشگاهی را هرچه بیشتر به شرایط طبیعی بدن نزدیک کنند.

از طرف دیگر، ترکیب کشت سلولی با تکنیک‌های مولکولی مانند PCR ،Real-Time PCR ،Sequencing و Single-cell Analysis امکان مطالعه بسیار دقیق‌تر سلول‌ها را فراهم کرده است.

2-9.سلول‌های چسبنده و معلق

Adherent Cell Culture

سلول‌های چسبنده برای رشد به یک سطح جامد نیاز دارند و معمولاً روی سطح ظروف کشت رشد می‌کنند. در این سیستم، میزان پوشش سطح یا Confluency یکی از شاخص‌های مهم برای ارزیابی رشد سلول و زمان مناسب پاساژ است.

Suspension Cell Culture

سلول‌های معلق برای رشد به اتصال به سطح نیاز ندارند و به‌صورت آزاد در محیط کشت قرار می‌گیرند. در این نوع کشت، تعداد سلول در واحد حجم، زنده‌مانی و الگوی رشد اهمیت بیشتری از Confluency دارند.

2-10. کشت دوبعدی و سه‌بعدی

در کشت دوبعدی (2D)، سلول‌ها معمولاً روی یک سطح صاف رشد می‌کنند و این روش به دلیل سادگی بسیار رایج است. در کشت سه‌بعدی (3D)، سلول‌ها در محیطی قرار می‌گیرند که امکان برهم‌کنش فضایی پیچیده‌تری را ایجاد می‌کند و می‌تواند در برخی مطالعات مدل نزدیک‌تری به شرایط بافتی فراهم کند.

یکی از نمونه‌های شناخته‌شده کشت سه‌بعدی، اسفروئید سلولی (Spheroid) است.

در این مدل، سلول‌ها به یکدیگر نزدیک می‌شوند و یک تجمع سه‌بعدی ایجاد می‌کنند.

درون اسفروئید، شرایط سلولی ممکن است با سطح بیرونی آن متفاوت باشد. برای مثال، دسترسی به اکسیژن و مواد غذایی می‌تواند در بخش‌های مختلف اسفروئید متفاوت باشد.

همین موضوع باعث می‌شود اسفروئیدها در برخی مطالعات سرطان و بررسی پاسخ دارویی ارزشمند باشند.

2-11. سلول‌های بنیادی و ارگانوئیدها

سلول‌های بنیادی به دلیل توانایی تکثیر و در شرایط مناسب، تمایز به انواع سلولی مختلف، اهمیت زیادی دارند. شرایط محیط کشت می‌تواند بر حفظ ویژگی‌های بنیادی یا ورود سلول به مسیر تمایز اثر بگذارد. ارگانوئیدها نیز ساختارهای سه‌بعدی سلولی هستند که برخی ویژگی‌های سازمان‌یافتگی بافت را بازسازی می‌کنند.

2-12.کشت همزمان چند نوع سلول

در بدن، سلول‌ها به‌ندرت به‌صورت کاملاً جدا از یکدیگر فعالیت می‌کنند.

سلول‌های مختلف از طریق تماس مستقیم و همچنین ترشح مولکول‌های پیام‌رسان بر یکدیگر اثر می‌گذارند.

برای بازسازی بخشی از این ارتباطات می‌توان از کشت همزمان سلول‌ها (Co-culture) استفاده کرد.

در این روش، دو یا چند نوع سلول در یک سیستم آزمایشگاهی با یکدیگر قرار می‌گیرند.

برای مثال، در یک مدل پژوهشی ممکن است سلول‌های سرطانی در کنار سلول‌های استرومایی یا سلول‌های ایمنی بررسی شوند.

2-13. کشت با تماس مستقیم و غیرمستقیم

در کشت همزمان، سلول‌ها ممکن است مستقیماً با یکدیگر تماس داشته باشند یا بدون تماس مستقیم، از طریق محیط مشترک بر یکدیگر اثر بگذارند.

در سیستم‌های غیرمستقیم، می‌توان از محفظه‌ها یا غشاهای نیمه‌تراوا استفاده کرد تا سلول‌ها جدا باقی بمانند اما برخی مولکول‌های ترشح‌شده بین آن‌ها جابه‌جا شود.

این نوع طراحی به پژوهشگر اجازه می‌دهد مشخص کند آیا یک اثر زیستی ناشی از تماس مستقیم سلولی است یا حاصل عوامل محلول در محیط.

2-14. کشت در ماتریکس خارج سلولی

سلول‌ها در بدن در محیطی به نام ماتریکس خارج سلولی (Extracellular Matrix) قرار دارند.

این ماتریکس فقط یک داربست فیزیکی نیست؛ بلکه مجموعه‌ای از مولکول‌هاست که می‌تواند پیام‌های زیستی مختلفی به سلول منتقل کند.

کلاژن، لامینین و فیبرونکتین از جمله اجزای مهم ماتریکس خارج سلولی هستند.

در برخی مدل‌های کشت سه‌بعدی، استفاده از ماتریکس یا مواد مشابه آن کمک می‌کند محیط اطراف سلول بیشتر به شرایط بافتی نزدیک شود.

1-15. کشت بافت

در برخی مطالعات، به‌جای جدا کردن کامل سلول‌ها، تلاش می‌شود ساختار بافت تا حد امکان حفظ شود.

به این روش‌ها می‌توان کشت بافت (Tissue Culture) گفت.

در کشت بافت، ارتباطات بین سلولی و ساختار طبیعی ممکن است بهتر از کشت سلول منفرد حفظ شود.

اما نگهداری بافت خارج از بدن نیز محدودیت‌های خاص خود را دارد و معمولاً از نظر نیازهای محیطی پیچیده‌تر از کشت یک رده سلولی ساده است.

1-16. کشت اندام‌واره‌ای

کشت اندام‌واره‌ای (Organotypic Culture) تلاش می‌کند بخشی از ساختار و سازمان بافت را در شرایط آزمایشگاهی حفظ کند.

این مدل‌ها از نظر پیچیدگی بین کشت سلولی ساده و سیستم‌های کامل بافتی قرار می‌گیرند.

در برخی مطالعات سرطان، پوست، سیستم عصبی و بافت‌های مختلف از مدل‌های اندام‌واره‌ای استفاده می‌شود.

مزیت اصلی این روش‌ها این است که برخی از تعاملات طبیعی سلول‌ها و ساختار بافتی بهتر حفظ می‌شود.

2-17. اهمیت ارتباط سلول با سلول

یکی از محدودیت‌های مدل‌های ساده کشت سلولی این است که رفتار سلول را در شرایطی بررسی می‌کنند که بسیاری از ارتباطات طبیعی آن حذف شده است.

در بدن، یک سلول ممکن است تحت تأثیر سلول‌های اطراف خود قرار گیرد و پاسخ آن به یک دارو یا عامل محیطی، حاصل تعامل چند نوع سلول باشد.

کشت همزمان می‌تواند بخشی از این پیچیدگی را بازسازی کند.

البته هرچه سیستم پیچیده‌تر شود، کنترل آزمایش و تفسیر نتایج نیز دشوارتر خواهد شد.

3. سلول و نیازهای آن در محیط کشت؛ از ترکیب محیط کشت تا کنترل شرایط فیزیولوژیک

3-1. نیازهای اساسی سلول

سلول برای زنده ماندن، رشد و تکثیر به مواد غذایی و شرایط محیطی مناسب نیاز دارد. مهم‌ترین این نیازها عبارت‌اند از:

• آب و نمک‌های معدنی

• آمینواسیدها برای ساخت پروتئین

• گلوکز به‌عنوان منبع انرژی

• ویتامین‌ها و ترکیبات کم‌مقدار

• سرم و فاکتورهای رشد، در صورت نیاز

• دما، pH، اکسیژن و اسموالالیته مناسب

نیازهای سلول‌ها یکسان نیست؛ بنابراین محیط کشت باید بر اساس نوع سلول و هدف آزمایش انتخاب شود.

3-2. جزای محیط کشت

نکته مهم: سرم همیشه ضروری نیست. برخی سلول‌ها در محیط‌های بدون سرم یا محیط‌های شیمیایی تعریف‌شده نیز رشد می‌کنند. استفاده از محیط‌های تعریف‌شده می‌تواند کنترل ترکیبات محیط و تکرارپذیری آزمایش را بهبود دهد.

3-3. کنترل شرایط فیزیکی و شیمیایی

• pH: بر فعالیت آنزیم‌ها، رشد و بقای سلول اثر می‌گذارد. سیستم بی‌کربنات و CO₂ در بسیاری از محیط‌های کشت برای تنظیم pH استفاده می‌شوند.

• دما: تغییرات شدید یا نوسانات مکرر دما می‌تواند باعث ایجاد استرس سلولی شود.

• CO₂: باید با سیستم بافری محیط کشت هماهنگ باشد.

• اکسیژن: نیاز سلول‌ها به اکسیژن متفاوت است و شرایط اکسیژن محیط می‌تواند بر رفتار آن‌ها اثر بگذارد.

• اسموالالیته: تغییر نامناسب غلظت مواد محلول می‌تواند تعادل آب سلول و عملکرد آن را مختل کند.

تغییر رنگ محیط کشت، برای مثال زرد شدن آن، ممکن است نشان‌دهنده افزایش اسیدیته باشد؛ اما به‌تنهایی اثبات‌کننده آلودگی نیست.

3-4. مواد زائد و آنتی‌بیوتیک‌ها

سلول‌ها در جریان متابولیسم موادی مانند لاکتات و آمونیاک تولید می‌کنند. تجمع این مواد می‌تواند شرایط رشد را نامناسب کند؛ بنابراین تعویض به‌موقع محیط کشت اهمیت دارد.

آنتی‌بیوتیک‌هایی مانند پنی‌سیلین و استرپتومایسین ممکن است رشد برخی باکتری‌ها را مهار کنند، اما:

• جایگزین تکنیک آسپتیک نیستند.

• ممکن است علائم برخی آلودگی‌ها را پنهان کنند.

• استفاده غیرضروری از آن‌ها می‌تواند بر نتایج آزمایش اثر بگذارد.

3-5. استانداردسازی محیط کشت

برای افزایش تکرارپذیری آزمایش‌ها باید نوع محیط، شماره بچ، تاریخ آماده‌سازی و شرایط نگهداری ثبت شود. همچنین محیط کشت باید پیش از استفاده به شرایط دمایی مناسب برسد، بدون آنکه برای مدت طولانی در شرایط نامناسب باقی بماند.

4. تجهیزات آزمایشگاه کشت سلولی

4-1. تجهیزات اصلی و کاربرد آن‌ها

کابینت ایمنی زیستی (BSC)

برای انجام کارهای سلولی در شرایط کنترل‌شده و کاهش احتمال آلودگی نمونه و مواجهه کاربر با عوامل زیستی استفاده می‌شود. فیلتر HEPA ذرات معلق را از جریان هوا حذف می‌کند، اما به‌تنهایی استریل بودن کشت را تضمین نمی‌کند.

انکوباتور CO₂

دما، رطوبت و غلظت CO₂ موردنیاز سلول را کنترل می‌کند. تنظیم نامناسب این شرایط می‌تواند pH محیط کشت و در نتیجه رشد و بقای سلول را تغییر دهد.

میکروسکوپ معکوس

برای مشاهده سلول‌های کشت‌شده، بررسی شکل سلول، تراکم، چسبندگی و شناسایی نشانه‌های احتمالی آلودگی به کار می‌رود. با این حال، ظاهر طبیعی سلول به‌تنهایی سلامت کامل آن را ثابت نمی‌کند.

سانتریفیوژ

برای جمع‌آوری و جداسازی سلول‌ها از محیط کشت استفاده می‌شود. شرایط سانتریفیوژ باید با نوع سلول و پروتکل آزمایش متناسب باشد تا به سلول‌ها آسیب وارد نشود.

شمارشگر سلولی (Cell Counter)

تعداد سلول‌ها را برای تنظیم تراکم کشت و استانداردسازی آزمایش مشخص می‌کند. برخی دستگاه‌ها قابلیت ارزیابی زنده‌مانی سلول را نیز دارند.

4-2. سایر تجهیزات مهم

• بن‌ماری: برای گرم کردن کنترل‌شده برخی محلول‌ها و مواد آزمایشگاهی.

• یخچال و فریزر: برای نگهداری محیط کشت، معرف‌ها و مواد حساس در شرایط مناسب.

• تجهیزات انجماد سلولی: برای ذخیره‌سازی طولانی‌مدت سلول‌ها.

• تجهیزات پایش و ثبت داده‌ها: برای بررسی و مستندسازی دما، CO₂، وضعیت فریزرها و سوابق سرویس تجهیزات.

در انجماد سلولی، موادی مانند DMSO می‌توانند تشکیل کریستال‌های یخ را کاهش دهند؛ با این حال، استفاده از آن‌ها باید مطابق پروتکل معتبر و متناسب با نوع سلول باشد.

4-3. نگهداری و کنترل کیفیت تجهیزات

برای عملکرد قابل اعتماد تجهیزات باید موارد زیر رعایت شوند:

1. کالیبراسیون و سرویس دوره‌ای.

2. بررسی عملکرد فیلترها و جریان هوا در کابینت ایمنی زیستی.

3. کنترل دما، CO₂ و رطوبت انکوباتور.

4. تمیزکاری و آلودگی‌زدایی منظم.

5. ثبت سوابق نگهداری، سرویس و گواهی تأیید عملکرد.

جمع‌بندی فصل چهارم: کیفیت کشت سلولی حاصل عملکرد صحیح مجموعه تجهیزات، مهارت کاربر و سیستم کنترل کیفیت است. حتی پیشرفته‌ترین تجهیزات نیز بدون نگهداری مناسب و رعایت اصول آسپتیک نمی‌توانند کشت سالم و قابل اعتماد را تضمین کنند.

5. اصول آسپتیک و کنترل آلودگی در کشت سلولی

موضوع اصلی: پیشگیری، شناسایی و مدیریت آلودگی‌های سلولی

5-1. تکنیک آسپتیک چیست؟

تکنیک آسپتیک (Aseptic Technique) مجموعه‌ای از اصول و رفتارهای عملی است که احتمال ورود میکروارگانیسم‌های ناخواسته به ظروف کشت، محیط کشت، معرف‌ها و سلول‌ها را به حداقل می‌رساند.

هدف آن استریل کردن کامل محیط آزمایشگاه نیست؛ بلکه جلوگیری از آلودگی هنگام کار با سلول‌هاست.

5-2. منابع اصلی آلودگی

آلودگی ممکن است از منابع زیر وارد کشت شود:

• کاربر: دست‌ها، لباس، مو و حرکات غیرکنترل‌شده

• تجهیزات و سطوح کاری که به‌درستی تمیز نشده‌اند

• محیط کشت و معرف‌هایی که نامناسب آماده یا نگهداری شده‌اند

• ظروف و سرسمپلرهای آلوده

• سایر کشت‌های آلوده در آزمایشگاه

5-3. اصول مهم پیشگیری از آلودگی

• رعایت بهداشت دست‌ها و استفاده از لباس مناسب آزمایشگاهی.

• آماده‌سازی و تمیز کردن سطح کابینت ایمنی زیستی.

• چیدمان منظم وسایل و جلوگیری از اختلال در جریان هوا.

• جداسازی مسیر وسایل تمیز از وسایل آلوده.

• باز نگه نداشتن غیرضروری ظروف کشت.

• جلوگیری از تماس نوک سرسمپلر با سطوح مشکوک یا آلوده.

• کاهش حرکات سریع و غیرضروری در کابینت.

• استفاده از روش‌های پایش و کنترل کیفیت به‌صورت منظم.

5-4. انواع آلودگی در کشت سلولی

5-5. چرا مایکوپلاسما اهمیت ویژه‌ای دارد؟

مایکوپلاسما از مهم‌ترین آلودگی‌های پنهان در کشت سلولی است. این باکتری فاقد دیواره سلولی است و ممکن است بدون ایجاد کدورت واضح، مدت طولانی در کشت باقی بماند.

آلودگی مایکوپلاسما می‌تواند بر موارد زیر اثر بگذارد:

• رشد و متابولیسم سلول

• بیان ژن و سنتز پروتئین

• پاسخ سلول به دارو

• قابلیت تکرارپذیری و اعتبار نتایج آزمایش

برای تشخیص آن می‌توان از روش‌های اختصاصی، از جمله روش‌های مولکولی مانند PCR، استفاده کرد. مشاهده میکروسکوپی به‌تنهایی برای رد آلودگی مایکوپلاسما کافی نیست.

5-6. نقش آنتی‌بیوتیک‌ها

آنتی‌بیوتیک‌ها نمی‌توانند جایگزین تکنیک آسپتیک شوند و تمام آلودگی‌ها را نیز کنترل نمی‌کنند. یک کشت که در حضور آنتی‌بیوتیک رشد طبیعی دارد، الزاماً عاری از آلودگی نیست.

5-7. اگر به آلودگی مشکوک شدیم، چه کنیم؟

1. کشت مشکوک را از کشت‌های سالم جدا کنید.

2. نشانه‌های ظاهری و وضعیت رشد سلول را بررسی کنید.

3. منشأ احتمالی آلودگی، از جمله معرف‌ها و تجهیزات مشترک، را ارزیابی کنید.

4. در صورت نیاز، آزمایش‌های اختصاصی تشخیص آلودگی انجام دهید.

5. درباره ادامه کار یا حذف کشت، بر اساس نوع آلودگی و ضوابط کنترل کیفیت آزمایشگاه تصمیم بگیرید.

همچنین رده‌های سلولی جدید باید پیش از ورود به مجموعه کشت‌های سالم، از نظر آلودگی و هویت بررسی شوند. نگهداری بانک سلولی سالم نیز امکان بازگشت به یک ذخیره معتبر را فراهم می‌کند.

5-8. پایش مستمر کشت

کنترل آلودگی تنها به پیشگیری محدود نمی‌شود. بررسی روزانه با میکروسکوپ، توجه به تغییرات مورفولوژی و رنگ محیط، ثبت رفتار غیرعادی سلول و انجام آزمون‌های اختصاصی، اجزای یک برنامه مناسب کنترل کیفیت هستند.

6. دریافت، آماده‌سازی، نگهداری و احیای سلول‌ها

فصل ششم از فایل «کشت سلول» درباره مراحلی است که از زمان ورود یک رده سلولی به آزمایشگاه آغاز می‌شوند و تا آماده‌شدن آن برای انجام آزمایش ادامه پیدا می‌کنند. هدف اصلی، ایجاد یک کشت سالم، پایدار، قابل اعتماد و قابل تکرار است.

6-1. انتخاب منبع سلولی و کنترل کیفیت

• سلول‌ها باید ترجیحاً از بانک‌های سلولی معتبر یا منابع قابل اعتماد تهیه شوند.

• هنگام دریافت سلول باید نام رده سلولی، گونه، منشأ بافت، شماره پاساژ و شرایط کشت ثبت شود.

• احراز هویت سلولی برای اطمینان از درست‌بودن هویت سلول ضروری است. برای بسیاری از رده‌های انسانی از روش STR Profiling استفاده می‌شود.

• پیش از واردکردن سلول جدید به مجموعه اصلی آزمایشگاه، باید آلودگی مایکوپلاسما بررسی شود؛ زیرا این آلودگی ممکن است بدون تغییر ظاهری واضح وجود داشته باشد.

6-2. ثبت اطلاعات و ایجاد بانک سلولی

اطلاعات هر رده سلولی باید به‌صورت منظم ثبت شوند، از جمله:

• نام رده سلولی و منبع تهیه

• تاریخ دریافت و تاریخ ذوب

• شماره پاساژ

• شرایط و محیط کشت

• نتایج بررسی هویت و مایکوپلاسما

دو اصطلاح مهم در این بخش عبارت‌اند از:

• Master Cell Bank (MCB): ذخیره اصلی سلول‌های تأییدشده که بهتر است برای کارهای روزمره استفاده نشود.

• Working Cell Bank (WCB): ذخیره کاری که کشت‌های روزمره از آن آغاز می‌شوند.

این روش کمک می‌کند در صورت آلودگی یا تغییر کشت‌های روزمره، امکان بازگشت به یک ذخیره معتبر وجود داشته باشد.

6-3. شماره پاساژ (Passage Number)

پاساژ زمانی انجام می‌شود که سلول‌ها رشد کرده‌اند و برای ادامه کشت به ظرف جدید منتقل می‌شوند.

شماره پاساژ اهمیت زیادی دارد؛ زیرا با ادامه کشت و افزایش پاساژ ممکن است ویژگی‌های سلول تغییر کنند، از جمله:

• شکل ظاهری و سرعت رشد

• ویژگی‌های ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی

• بیان ژن

• پاسخ به دارو

• توانایی تمایز سلولی

بنابراین، ثبت شماره پاساژ برای مقایسه معتبر نتایج آزمایش‌ها ضروری است.

6-4. انجماد و نگهداری سلول‌ها

هدف از انجماد، متوقف‌کردن تقریباً کامل فعالیت متابولیک سلول و فراهم‌کردن امکان نگهداری طولانی‌مدت آن است.

• DMSO یکی از مواد محافظ انجماد است که به کاهش آسیب ناشی از تشکیل کریستال‌های یخ کمک می‌کند.

• انجماد نامناسب می‌تواند به غشا و ساختارهای داخلی سلول آسیب بزند.

• سلول‌ها باید در سیستم برودتی مناسب، مانند سیستم‌های نگهداری با نیتروژن مایع یا فاز بخار آن، نگهداری شوند.

• نوسان دما می‌تواند به سلول آسیب برساند؛ بنابراین پایش دما اهمیت دارد.

• برچسب هر ویال باید اطلاعاتی مانند نام رده سلولی، شماره پاساژ، تاریخ انجماد و شناسه ذخیره را داشته باشد.

6-5. ذوب سلول و دوره بازیابی

ذوب‌کردن یکی از حساس‌ترین مراحل چرخه نگهداری سلول است؛ زیرا سلول از دمای بسیار پایین به شرایط کشت بازمی‌گردد.

نکات مهم این مرحله:

1. ذوب باید طبق پروتکل معتبر همان رده سلولی و به‌صورت کنترل‌شده انجام شود.

2. ماده محافظ انجماد، مانند DMSO، باید پس از ذوب‌شدن به روش مناسب مدیریت یا از محیط کشت خارج شود.

3. سلول‌ها پس از ذوب به دوره بازیابی (Recovery Period) نیاز دارند.

4. در این مدت ممکن است رشد سلول کندتر باشد، شکل آن موقتاً تغییر کند یا بخشی از سلول‌ها از بین بروند.

5. بهتر است سلول‌ها پیش از ورود به آزمایش‌های حساس، به شرایط پایدار برسند؛ مگر اینکه پروتکل روش دیگری را توصیه کرده باشد.

6-6. تراکم کاشت و اتصال سلولی

تراکم کاشت (Seeding Density) یعنی تعداد سلول‌هایی که در یک ظرف کشت قرار داده می‌شوند.

• تراکم بسیار پایین ممکن است رشد بعضی سلول‌ها را مختل کند.

• تراکم بسیار بالا باعث رسیدن سریع کشت به تراکم زیاد و تغییر شرایط متابولیک محیط می‌شود.

• سلول‌های چسبنده (Adherent) برای رشد به سطح مناسب نیاز دارند؛ درحالی‌که سلول‌های معلق (Suspension) در محیط کشت شناور می‌مانند.

• برخی سلول‌های چسبنده برای اتصال مناسب به پوشش‌های سطحی ویژه نیاز دارند.

6-7.سیالیت یا Confluency چیست؟

سیالیت نشان می‌دهد چه نسبتی از سطح قابل رشد ظرف توسط سلول‌های چسبنده پوشیده شده است. با افزایش سیالیت، فضای آزاد برای رشد کاهش می‌یابد و رفتار سلول‌ها نیز ممکن است تغییر کند. بنابراین زمان پاساژ باید با توجه به نوع سلول و شرایط واقعی کشت تعیین شود.

6-8. پاساژ سلول‌های چسبنده

برای انتقال سلول‌های چسبنده به ظرف جدید، ابتدا باید سلول‌ها از سطح جدا شوند. یکی از روش‌های رایج، استفاده از تریپسین (Trypsin) است.

• تریپسین پروتئینی است که به جداشدن سلول از سطح کمک می‌کند.

• مدت تماس سلول با تریپسین باید متناسب با نوع سلول و پروتکل باشد.

• تماس بیش از حد می‌تواند به پروتئین‌های سطحی آسیب بزند و بازیابی سلول را کاهش دهد.

• پس از جداسازی، شمارش سلولی به تعیین تعداد مناسب برای کشت بعدی کمک می‌کند.

• نسبت تقسیم (Split Ratio) روشی برای توصیف تقسیم کشت است؛ اما در آزمایش‌های حساس، شمارش دقیق و تعیین تراکم کاشت کنترل بیشتری فراهم می‌کند.

6-9. چه زمانی سلول برای آزمایش آماده است؟

پیش از شروع آزمایش اصلی، باید وضعیت کشت بررسی شود. مهم‌ترین معیارها عبارت‌اند از:

7. شمارش سلولی چیست و چه زمانی به آن نیاز داریم؟

شمارش سلولی روشی برای برآورد تعداد سلول‌های موجود در یک نمونه است و در بسیاری از مراحل کشت سلولی کاربرد دارد؛ از تنظیم تراکم کاشت و تقسیم کشت گرفته تا آماده‌سازی نمونه برای آزمون‌های عملکردی، مولکولی یا سمیت سلولی. شمارش دقیق کمک می‌کند شرایط شروع آزمایش میان نمونه‌ها و تکرارها تا حد امکان یکسان باشد.

روش شمارش باید با نوع سلول، ویژگی نمونه و دقت مورد نیاز متناسب باشد. در برخی آزمایشگاه‌ها از هموسیتومتر و شمارش دستی استفاده می‌شود و در برخی دیگر شمارشگرهای خودکار به کار می‌روند. هیچ روشی بدون محدودیت نیست؛ تجمع سلول‌ها، وجود بقایای سلولی، یکنواخت نبودن سوسپانسیون و تنظیمات نادرست دستگاه می‌توانند نتیجه را تحت تأثیر قرار دهند.

7-1. شمارش دستی و شمارشگر خودکار

در شمارش دستی، اپراتور سلول‌ها را در نواحی مشخص‌شده محفظه شمارش مشاهده و طبق دستورالعمل، تعداد آن‌ها را محاسبه می‌کند. این روش به مهارت کاربر، یکنواختی نمونه و رعایت قواعد شمارش وابسته است. شمارشگر خودکار می‌تواند سرعت و استانداردسازی را افزایش دهد، اما عملکرد آن به نوع سلول، محدوده اندازه، کیفیت تصویر یا حسگر و الگوریتم تشخیص وابسته است.

برای مقایسه نتایج در طول زمان، بهتر است روش شمارش، نوع ابزار، رقیق‌سازی نمونه و هرگونه تنظیم مهم ثابت نگه داشته و در سوابق ثبت شود. در صورت مشاهده نتیجه‌ای که با ظاهر کشت یا سابقه رشد همخوانی ندارد، بررسی نمونه و تکرار اندازه‌گیری می‌تواند از انتقال خطا به مراحل بعدی جلوگیری کند.

8. زنده‌مانی سلولی؛ تفاوت تعداد کل با تعداد سلول زنده

تعداد کل سلول‌ها به‌تنهایی نشان نمی‌دهد چه بخشی از جمعیت توانایی حفظ یکپارچگی غشا یا ادامه فعالیت زیستی را دارد. زنده‌مانی سلولی (Cell Viability) به کمک آزمون‌های مناسب برآورد می‌شود و تفسیر آن به اصل روش وابسته است؛ برخی آزمون‌ها یکپارچگی غشا را بررسی می‌کنند و برخی دیگر بر فعالیت متابولیکی یا شاخص‌های زیستی دیگر تکیه دارند.

در روش‌های مبتنی بر رنگ‌آمیزی، رنگ مورد استفاده و نحوه تفسیر باید مطابق دستورالعمل آزمون باشد. در آزمون‌های متابولیکی نیز باید توجه داشت که تغییر سیگنال لزوماً فقط ناشی از تغییر تعداد سلول زنده نیست؛ تیمارها ممکن است فعالیت متابولیکی هر سلول را نیز تغییر دهند. بنابراین انتخاب آزمون باید بر اساس سؤال پژوهش انجام شود.

8-1. چرا زنده‌مانی در طراحی آزمایش مهم است؟

اگر دو گروه آزمایشی با درصد زنده‌مانی یا تعداد سلول زنده متفاوت وارد مطالعه شوند، تفاوت مشاهده‌شده ممکن است تنها ناشی از اثر تیمار نباشد. برای مثال، در آزمون سمیت یا بیان ژن، کاهش تعداد سلول‌های زنده می‌تواند مقدار سیگنال نهایی را تغییر دهد. ثبت تعداد سلول، درصد زنده‌مانی و شرایط آماده‌سازی نمونه به تفسیر دقیق‌تر نتایج کمک می‌کند.

8-2. محدودیت‌های تفسیر آزمون زنده‌مانی

نتیجه یک آزمون زنده‌مانی باید در محدوده کاربرد تأییدشده همان روش تفسیر شود. کنترل مثبت و منفی مناسب، تکرارهای کافی، رعایت زمان انکوباسیون و توجه به تداخل احتمالی ترکیبات آزمایشی با معرف، از عوامل مهم کیفیت آزمون هستند. در مطالعات مقایسه‌ای، استفاده از یک روش ثابت برای تمام گروه‌ها اهمیت ویژه‌ای دارد.

9. منحنی رشد سلولی و زمان دوبرابرشدن جمعیت

منحنی رشد سلولی نشان می‌دهد تعداد سلول‌ها در طول زمان چگونه تغییر می‌کند. در بسیاری از سامانه‌های کشت، رشد را می‌توان به‌صورت کلی در چند مرحله توصیف کرد: مرحله سازگاری یا تأخیر، مرحله رشد سریع، مرحله کاهش سرعت رشد و در نهایت مرحله‌ای که رشد خالص محدود می‌شود. شکل دقیق منحنی به نوع سلول، محیط کشت، تراکم اولیه و شرایط فیزیکی وابسته است و همه رده‌ها الگوی کاملاً یکسانی ندارند.

ثبت تعداد سلول در چند زمان مشخص، در صورت طراحی مناسب، امکان مقایسه روند رشد میان شرایط مختلف را فراهم می‌کند. در این تحلیل باید شرایط نمونه‌برداری، روش شمارش، تعداد تکرارها و وضعیت زنده‌مانی در نظر گرفته شود. اندازه‌گیری‌های پراکنده یا استفاده از روش‌های متفاوت در زمان‌های مختلف ممکن است تفسیر منحنی را دشوار کند.

9-1. زمان دوبرابرشدن چیست؟

زمان دوبرابرشدن جمعیت (Population Doubling Time) مدت زمانی است که جمعیت سلولی در شرایط مشخص برای دو برابرشدن نیاز دارد. این شاخص برای توصیف رشد و مقایسه شرایط کشت مفید است، اما فقط زمانی قابل تفسیر است که داده‌ها از بازه‌ای مناسب از رشد به دست آمده باشند و فرض‌های محاسبه برقرار باشند. در شرایطی که رشد متوقف شده، زنده‌مانی افت کرده یا جمعیت ناهمگن است، استفاده از یک عدد منفرد می‌تواند گمراه‌کننده باشد.

زمان دوبرابرشدن یک ویژگی ثابت و همیشگی برای هر رده سلولی نیست. تغییر محیط، تراکم اولیه، شماره پاساژ، شرایط انکوباتور و وضعیت سلامت کشت می‌توانند آن را تغییر دهند؛ بنابراین بهتر است همراه با شرایط آزمایش و بازه زمانی اندازه‌گیری گزارش شود.

10. احراز هویت رده سلولی و اهمیت آن در تکرارپذیری

احراز هویت سلولی (Cell Line Authentication) به بررسی این موضوع می‌پردازد که کشت مورد استفاده واقعاً متعلق به رده سلولی مورد نظر باشد. جابه‌جایی نمونه‌ها، برچسب‌گذاری اشتباه یا آلودگی متقاطع ممکن است باعث شود آزمایش روی رده‌ای غیر از رده ادعاشده انجام شود. در این حالت، حتی اجرای دقیق آزمایش نیز لزوماً به نتیجه معتبر منجر نمی‌شود.

روش احراز هویت به گونه و نوع سلول وابسته است. برای بسیاری از رده‌های سلولی انسانی، پروفایل‌سازی STR یکی از روش‌های رایج است؛ اما باید نتیجه با مرجع مناسب مقایسه و محدودیت‌های روش در نظر گرفته شود. برای سایر گونه‌ها یا انواع سلولی، روش مناسب ممکن است متفاوت باشد.

احراز هویت جایگزین کنترل آلودگی نیست. یک رده سلولی می‌تواند هویت درست داشته باشد، اما به مایکوپلاسما آلوده باشد؛ همچنین ممکن است کشت از نظر ظاهری طبیعی به نظر برسد، اما هویت آن تأیید نشده باشد. بنابراین هویت سلول و وضعیت آلودگی باید به‌عنوان دو محور مستقل کنترل کیفیت بررسی شوند.

11. کنترل کیفیت کشت سلولی پیش از آزمایش‌های حساس

کنترل کیفیت تنها به بررسی روزانه شکل سلول محدود نمی‌شود. برای آزمایش‌هایی که نتایج آن‌ها باید قابل تکرار یا قابل انتشار باشند، لازم است وضعیت کشت، سابقه نگهداری و معیارهای پذیرش از پیش تعریف شوند. این معیارها با توجه به نوع سلول و هدف آزمایش متفاوت‌اند.

• هویت رده سلولی و منبع تهیه آن مشخص و قابل ردیابی است.
• شماره پاساژ و تاریخ‌های مهم کشت ثبت شده‌اند.
• مورفولوژی و الگوی رشد با محدوده مورد انتظار سازگارند.
• وضعیت آلودگی، از جمله مایکوپلاسما، مطابق برنامه آزمایشگاه بررسی شده است.
• تراکم، تعداد سلول زنده و زنده‌مانی با نیاز آزمایش هماهنگ‌اند.
• محیط کشت، معرف‌ها و شرایط انکوباتور مطابق روش تعریف‌شده هستند.
• هرگونه انحراف، تغییر غیرعادی یا نتیجه نامطمئن ثبت و ارزیابی شده است.

وجود یک چک‌لیست ثابت باعث می‌شود تصمیم‌گیری کمتر به قضاوت شخصی وابسته باشد. اگر کشت یکی از معیارهای پذیرش را برآورده نمی‌کند، بهتر است پیش از شروع آزمایش مشخص شود که آیا می‌توان با توجیه علمی و مستندسازی ادامه داد یا باید کشت بررسی و آزمایش به تعویق انداخته شود.

12. عوامل ایجادکننده تغییرپذیری در نتایج کشت سلولی

تغییرپذیری در کشت سلولی می‌تواند از عوامل زیستی، محیطی و فنی ناشی شود. حتی زمانی که نام رده سلولی یکسان است، تفاوت در شماره پاساژ، تراکم اولیه، مدت بازیابی پس از ذوب، ترکیب یا شماره بچ محیط کشت و شرایط انکوباتور ممکن است بر نتیجه اثر بگذارد.

برای کاهش تغییرپذیری، لازم است متغیرهای مهم از ابتدا تعریف شوند و تا حد امکان در گروه‌های مقایسه‌ای ثابت بمانند. در کنار این موضوع، استفاده از تکرارهای زیستی و فنی متناسب با طراحی مطالعه، ثبت دقیق داده‌ها و گزارش محدودیت‌ها به ارزیابی اعتبار نتایج کمک می‌کند.

12-1. تکرار فنی و تکرار زیستی

تکرار فنی معمولاً به اندازه‌گیری‌های تکراری از یک نمونه یا ماده زیستی مشابه اشاره دارد و برای بررسی پراکندگی ناشی از فرایند اندازه‌گیری مفید است. تکرار زیستی از نمونه‌ها یا واحدهای زیستی مستقل حاصل می‌شود و اطلاعات متفاوتی درباره تغییرپذیری زیستی فراهم می‌کند. تعداد و نوع تکرارها باید با پرسش پژوهش و طراحی آماری هماهنگ باشد؛ چند چاهک از یک نمونه لزوماً معادل چند تکرار زیستی مستقل نیست.

12-2. ثبت تغییرات و انحراف از روش استاندارد

اگر در طول کشت، محیط یا معرف تغییر کند، دستگاه از محدوده معمول خارج شود یا زمان‌بندی آزمایش متفاوت باشد، این موارد باید ثبت شوند. مستندسازی به پژوهشگر کمک می‌کند در زمان تحلیل داده‌ها، اثر احتمالی تغییرات را در نظر بگیرد و در صورت نیاز آزمایش را تکرار کند.

13. پرسش‌های متداول تکمیلی

آیا تعداد سلول بیشتر همیشه به معنی کشت بهتر است؟

خیر. تعداد بالا بدون توجه به زنده‌مانی، مورفولوژی، تراکم و وضعیت آلودگی نمی‌تواند سلامت کشت را ثابت کند. کیفیت کشت باید با چند شاخص و بر اساس هدف آزمایش ارزیابی شود.

آیا آزمون زنده‌مانی و شمارش سلولی یک چیز را اندازه می‌گیرند؟

خیر. شمارش سلولی تعداد سلول‌ها را برآورد می‌کند، در حالی که آزمون زنده‌مانی شاخصی از زنده‌بودن یا فعالیت زیستی آن‌ها ارائه می‌دهد. این دو سنجش مکمل یکدیگرند.

چرا احراز هویت سلولی با کنترل مایکوپلاسما تفاوت دارد؟

احراز هویت مشخص می‌کند کشت به کدام رده سلولی تعلق دارد؛ آزمون مایکوپلاسما وجود یا نبود این آلودگی را بررسی می‌کند. برای اطمینان از کیفیت کشت، هر دو موضوع باید جداگانه مورد توجه قرار گیرند.

آیا زمان دوبرابرشدن برای هر رده سلولی ثابت است؟

خیر. این شاخص به شرایط کشت، وضعیت سلول، تراکم اولیه و بازه اندازه‌گیری وابسته است و باید همراه با شرایط آزمایش گزارش شود.

گردآوری شده توسط جناب آقای فرشاد ساسانیان

منابع پیشنهادی مقاله 

1.      Freshney, R. I. (2010). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (6th ed.). Wiley-Blackwell.  لینک مستقیم منبع

2.      Freshney, R. I. & Freshney, R. I. (2005). Primary Culture. In Culture of Animal Cells.  لینک مستقیم منبع

3.      ATCC. Primary Cell Culture Guide.  لینک مستقیم منبع

4.      ATCC. Maintaining Cells.  لینک مستقیم منبع