نوشته‌ها

DNA Sequencing & Sanger Sequencing

توالی یابی DNA (DNA Sequencing)
به معنای پیدا کردن توالی نوکلئوتید ها از جمله آدنین تیمین سیتوزین و گوانین در قطعه ای از دی ان ای گفته می شود. امروزه با به کار بردن ابزارهای مناسب، توالی یابی قطعه ای از DNA کار بسیار ساده ای است اگرچه توالی یابی کل ژنوم یعنی تمام DNA هنوز کاری پیچیده به نظر می‌رسد.
این کار نیازمند شکستن دی ان ای به قطعات کوچکتر است. سپس باید این قطعات کوچک توالی یابی شده و در کنار هم در قالب یک مجموعه بسیار بلند و طولانی قرار بگیرد. اگرچه باید اذعان داشت که به واسطه تلاش هایی که در دو دهه گذشته انجام شده توالی یابی ژنوم بسیار سریعتر و راحت تر از آنچه در پروژه توالی یابی ژنوم انسان اتفاق افتاده صورت می گیرد.
در اینجا تلاش می‌کنیم تا روش های مختلف توالی یابی را شرح داده و تمرکز خود را بر روی یکی از روش های پرکاربرد به نام توالی یابی سنگر قرار دهیم

توالی یابی سنگر یا روش خاتمه دادن زنجیره ای (Sanger Sequencing)
بخش هایی از دی ان ای که طولی بیشتر از ۹۰۰ جفت باز دارند معمولاً با استفاده از تکنیک ای به نام توالی یابی سنگر یا روش خاتمه دادن زنجیره ای توالی یابی می شود. این روش توسط یک بیوشیمی دان انگلیسی به نام فرد سنگر و همکارانش در سال ۱۹۷۷ ابداع شد.
در پروژه ژنوم انسانی از تکنیک توالی یابی سنگر برای توالی یابی قطعات به نسبت کوچکتر دی ان ای نیز استفاده شد. البته این قطعات DNA الزاماً کمتر از ۹۰۰ جفت باز طول نداشتند ولی محققان می توانند هر قطعه طولانی را با استفاده از چند بار توالی یابی سنگر توالی یابی کند. پس از آن توالی قطعات بر اساس بخش هایی که همپوشانی دارند، پشت سر هم قرار گرفته و ساختار کلی ژنوم به مرور به دست می آید.
اگرچه امروزه برای توالی یابی ژنوم از روش‌های سریعتر و ارزانتر استفاده می شود ولی همچنان توالی یابی سنگر یکی از پرکاربردترین روش های توالی یابی قطعات دی ان ای است. از جمله می‌توان به توالی یابی قطعات مشخصی از دی آن ای برای کلونینگ و یا قطعات به وجود آمده دی آن ای از طریق پی سی آر اشاره کرد. توالی یابی سنگر (Sanger Sequencing) شامل کپی‌کردن قسمت خاصی از دی ان ای به تعداد بسیار بالاست. موادی که در این تکنیک استفاده می‌شود مشابه مواد مصرفی در پی سی آر و یا فرایند تکثیر دی ان ای در جانداران است. این مواد عبارتند از:
• آنزیم دی ان ای پلیمراز
• پرایمر که قطعه کوتاهی از دی ان ای تک رشته ای است که به الگوی دی ان ای متصل شده و به عنوان نقطه شروع برای پلیمراز تلقی می شود
• چهار نوکلئوتید استفاده شده در دی ان ای که عبارتند از گوانین، سیتوزین، آدنین و تیمین
• و نهایتاً قالب یا تمپلیت DNA که قرار است تکثیر شود
و البته تکنیک توالی یابی سنگر حاوی یک ماده خاص دیگر نیز هست و این ماده پایان دهنده زنجیره ای (Chain Terminator) و یا نسخه دی دی اُکسی(ddNTP) هر یک از چهار نوکلئوتید استفاده شده در دی ان ای می باشد که هر کدام با استفاده از رنگ متفاوتی علامت گذاری شده اند.

دی دی اکسی نوکلئوتیدها بسیار شبیه دی اکسی نوکلئوتید هستند با این تفاوت که آنها بر روی کربن ۳′ حلقه قندی خود گروه هیدروکسیل ندارند. در نوکلئوتیدهای معمولی گروه هیدروکسیل روی کربن ۳′ همانند یک قلاب عمل می کند و اجازه می دهد که نوکلئوتیدهای دیگر به زنجیره اضافه شوند.
وقتی که دی دی اکسی نوکلئوتید به زنجیره اضافه می شود دیگر هیدروکسیل وجود ندارد، بنابراین نوکلئوتیدهای دیگری نمی توانند به زنجیره اضافه شوند. در این حالت زنجیره پایان می‌یابد و آخرین نقطه زنجیره حاوی دی دی اکسی نوکلئوتید خواهد بود و هر دی دی اکسی نوکلئوتید نیز با توجه به باز خاص خود دارای یک رنگ مشخص است.

روش انجام توالی یابی سنگر
DNA مورد نظر برای توالی یابی به همراه پرایمر، دی ان ای پلیمراز، نوکلئوتید ها و همچنین دی دی اکسی نوکلئوتید هایی که با استفاده از رنگ علامت دار شده اند درون یک میکروتیوب ترکیب می‌شوند. نکته اینجاست که مقدار دی دی اکسی نوکلئوتید از نوکلئوتید های معمولی بسیار کمتر است. سپس دما بالا میرود تا دو رشته دی ان ای واسرشته شود، سپس دما پایین می‌آید تا پرایمر بتواند به دی ان ای تک رشته ای متصل شود. پس از اینکه پرایمر به DNA تک رشته ای متصل شد، دوباره دما بالا می رود تا پلیمراز بتواند ساختن دی ان ای را از جایی که پرایمر متصل شده آغاز کند. دی ان ای پلیمراز پس از آن شروع می‌کند به اضافه کردن نوکلئوتید ها به دی ان ای و ادامه دادن زنجیره تا جایی که یک دی دی اکسی نوکلئوتید به جای یک نوکلئوتید عادی به زنجیره اضافه کند. در این مرحله دیگر امکان اضافه شدن نوکلئوتیدهای بعدی وجود نخواهد داشت، بنابراین دی دی اکسی نوکلئوتید آخرین نقطه زنجیره ای ساخته شده خواهد بود.
این فرآیند در چند مرحله تکرار خواهد شد. بعد از اینکه این مراحل تکرار شد و سیکل به پایان رسید عملا تضمین شده که دی دی اکسی نوکلئوتید حتما بر روی تک تک موقعیت‌ها و نوکلئوتیدهای قطعه مورد نظر دی ان ای حداقل یکبار قرار گرفته باشد و این بدان معناست که در محلول ما قطعات مختلف با طول های متفاوتی از دی ان ای وجود دارد که انتهای هر یک، یک دی دی اکسی نوکلئوتید دارای رنگ مشخص قرار گرفته.
پس از انجام واکنش، این قطعات از داخل لوله بسیار نازک مویین (Capillary) و ترکیبی از ژل یا پلیمر (Polymer) عبور می کنند که به این فرآیند الکتروفورز کپیلاری (Capillary Electrophoresis) و یا الکتروفورز مویینه می گویند.
در این فرآیند الکتروفورز، قطعات کوچک تر سریعتر از قطعات بزرگ تری دی ان ای می توانند از منافذ ژل / پلیمر عبور کنند و در انتها، وقتی که هر قطعه دی ان ای به نقطه پایان می رسد، با استفاده از لیزر، رنگ متصل به دی دی اکسی نوکلئوتید تحریک شده و با ساطع کردن نور فلورسنت، نوع آخرین نوکلئوتید تشخیص داده میشود.
کوچکترین قطعه DNA که تنها شامل یک دی دی اکسی نوکلئوتید پس از پرایمر میشود، زودتر از همه از خط پایان می گذرد. پس از آن قطعه ای که شامل یک نوکلئوتید و یک دی دی اکسی نوکلئوتید است از خط پایان گذشته و به همین صورت قطعات به ترتیب طول، از کوتاه ترین تا بلندترین قطعه از خط پایان عبور می کند. بنابراین با رنگ هایی که توسط یک آشکارساز یکی پس از دیگری خوانده می شود می توان توالی دی ان ای را مشخص کرد. اطلاعات خوانده شده توسط دستگاه شامل قله هایی است که هرکدام شدت نور فلورسنس تشخیص داده شده را مشخص می کنند.

کاربردها و محدودیت های توالی یابی سنگر
توالی یابی سنگر امکان توالی یابی قطعات بلند دی ان ای را تا حدود ۹۰۰ جفت باز فراهم می کند.
• این روش برای توالی یابی قطعات مجزایی از DNA مانند دی ان ای های کپی شده در پی سی آر (PCR) و یا پلاسمیدهای باکتریایی استفاده می‌شود.
اگرچه این روش برای پروژه های بزرگتر مانند توالی یابی کل ژنوم یا متاژنوم نامناسب و گران قیمت است برای چنین پروژه هایی روش های مناسب تر، کارا تر و سریع تری مانند ان جی اس ابداع شده و استفاده می شود.

نسل بعدی توالی یابی (NGS)

توالی یابی DNA مسیر طولانی را پس از روزگار استفاده از کروماتوگرافی دو بعدی در دهه ۱۹۷۰ طی کرده است. با ظهور روش خاتمه زنجیره سنگر (Sanger Chain Termination) در سال ۱۹۷۷، دانشمندان توانایی توالی یابی DNA را به شیوه ای قابل اطمینان و قابل تایید بدست آوردند. یک دهه بعد Applied Biosystems نخستین دستگاه توالی یابی خودکار با که بر اساس الکترو فورز مویینه (Capillary Electrophoresis) کار می کرد تولید و به بازار معرفی کرد. دستگاه های AB370 در سال ۱۹۸۷ و AB3730xl در سال ۱۹۹۸ را روانه بازار شدند که به عنوان تجهیزات اصلی برای پروژه ه ای ژنوم انسانی، که تحت رهبری NIH و  Celera اجرا می شد، به کار گرفته شدند.

در حالی که این دستگاه های نسل اول توالی یابی در طول زمان، توانایی بالایی برای دوره زمانی خود داشتند،Genome Analyser در سال ۲۰۰۵ ظهور کرد و قابلیت توالی یابی را از ۸۴ کیلوباز (kb) در هر اجرا به ۱ گیگاباز رساند. تکنیک توالی یابی با خوانش کوتاه و توالی یابی موازی با حجم بسیار بالا یک رویکرد اساسا متفاوت بود که انقلابی در این عرصه بوجود آورد و قابلیت و سرعت توالی یابی را افزایش داد و نسل بعدی توالی یابی (NGS) را بوجود آورد.

نسل بعدی توالی یابی (NGS)

نسل بعدی توالی یابی (NGS)

در سال ۲۰۰۵، تنها یک اجرا با استفاده از دستگاه ژنوم آنالایزر می توانست تقریبا یک گیگاباز داده تولید کند. تا سال ۲۰۱۴، این نرخ به ۱٫۸ تراباز (tb) تنها در یک تک اجرا افزایش یافت که افزایش چشمگیر ۱۰۰۰ برابری را موجب شده بود. این نکته می تواند قابل توجه باشد که اولین توالی یابی کامل ژنوم انسانی که در سال ۲۰۰۱ در Science and Nature به چاپ رسید، ۱۵ سال طول کشید و تقریبا سه میلیارد دلار هزینه برداشت. در مقابل سیستم HiSeq X® Ten که در سال ۲۰۱۴ عرضه شده است، می تواند بیش از ۴۵ ژنوم انسان را تنها در یک روز با هزینه ی ۱۰۰۰ دلار برای هر یک از نمونه ها توالی یابی کند. فراتر از افزایش قابل توجهی که در خروجی داده ها بوجود آمده، معرفی فناوری NGS نگرش دانشمندان را درباره اطلاعات ژنتیکی به کلی تغییر داده است. توالی یابی ژنوم با این سرعت و هزینه، امکان توالی یابی در سطح جمعیتی وسیع را ایجاد می کند و می تواند پایه و اساس پزشکی ژنوم فردی را به عنوان بخشی از استاندارد مراقبت های پزشکی، بوجود آورد. محققان اکنون می توانند هزاران و یا حتی ده ها هزار ژنوم را در سال تجزیه و تحلیل کند. همانطور که اریک لاندر، مدیر موسس MIT و هاروارد و رهبر اصلی پروژه Human Genome، اظهار داشته:

“میزان پیشرفت خیره کننده است. همانطور که هزینه ها همچنان پایین می آیند، ما وارد دوره ای می‌شویم که قادر خواهیم بود فهرست کامل ژن های بیماری ها را در اختیار داشته باشیم. این فهرست به ما اجازه خواهد داد تا داده های هزاران نفر را بررسی کرده  و تفاوت ها را بین آنها بهتر مشاهده کنیم تا بتوانیم ژن‌های معیوب که باعث سرطان، اوتیسم، بیماری قلبی، یا اسکیزوفرنی می شوند را شناسایی کنیم.”