Probe Based Real Time qPCR

Probe-Based Real-Time qPCR

در بحث بیولوژی مولکولی، روش qpcr (real-time quantitative PCR) برای محققان و افراد آزمایشگاهی، ابزاری بسیار مفید می باشد. همچنین در صورت وجود تعداد نمونه های بسیار در آزمایشگاه با استفاده از این روش می توان آن ها را از لحاظ کمیت و مقایسه تجریه تحلیل کرد.
برای تهیه یک واکنش qpcr به موارد زیر نیاز است:
• DNA/CDNA: الگویی برای ایجاد واکنش
• DNA polymaraseمقاوم به حرارت: آنزیمی برای کاتالیز کردن تکثیر DNA
• Primers: الیگونوکلئوتیدهای کوتاه که هدف DNA را تکمیل و به آن متصل می شوند.
• DNTPs: ترکیب های نوکلئیک اسید (A,T,C,G) برای تولید کردن DNA جدید.
• MgCL2: یک عامل مشترک در ایجاد واکنش qpcr.
• Buffer: یک راه حل مهم برای پشتیبانی از شرایط شیمیایی مورد نیاز برای واکنش
• Fluorescent reporter molecule: مولکولی که سیگنال فلورسنت مربوط به DNA تقویت شده را ساطع می کند.
Fluorescent Probe:
این پروب بر اساس توالی خاصی در الگوی DNA سنتز می شود ، سپس پرایمر ها یا پروب هایی دارای برچسب به مناطق هدف DNA متصل می شوند. روش qpcr با پروب حساس و خاص تر از روش رنگ فلورسنت است.
Taqman® probe:
اساس این روش خاصیت ’exonuclease activity 5’–>3 است . در این روش یک reporter در انتهای 5 و یک quencher در انتهای 3 وجود دارد. در انتهای 3 یک بلاکر هم وجود دارد که باعث می شود که پروب به عنوان پرایمر استفاده نشود.

هنگامی که پروب ثابت است، فاصله کم بین reporter و quencher ، امکان انتقال انرژی تحریک پذیر و انرژی تشدیدی فلورسانس از Reporter به quencher فراهم می کند. آنزیم مورد استفاده شده پس از نزدیک شدن به پروب آن را تجزیه می کند در نتیجه quencher نور ساطع شده توسط reporter را جذب می کند. در هر سيكل با آزادشدن بيشتر Reporter ماده فلورسانس بيشتري ساطع گرديده و توسط دستگاه ثبت مي شود.