RT-PCR یا (reverse transcription- PCR) که معادل فارسی آن واکنش زنجیره ای پلیمراز معکوس نامیده می شود شامل دو مرحله می باشد که در مرحله اول ابتدا یک RNA توسط آنزیم RT (ریورس ترانس کریپتاز) یا رونوشت برداری معکوس تبدیل به DNA مکمل یا (cDNA) می شود و در مرحله دوم  cDNA حاصل از مرحله اول می تواند به عنوان یک الگو برای PCR استفاده شود.

ترانس کریپتازهای معکوس در بسیاری از ارگانیسم ها از جمله باکتری ها، حیوانات و گیاهان و همچنین ویروس ها شناسایی شده اند. نقش طبیعی ترانس کریپتاز معکوس تبدیل توالی های RNA به توالی های cDNA است که قابلیت وارد شدن به نواحی مختلف ژنوم را دارند.

ترانس کریپتازهای معکوس DNA  پلیمرازهای وابسته به RNA هستند, گروهی از آنزیم هایی هستند نقش منحصر به فردی در جریان اطلاعات ژنتیکی دارند. این آنزیم ها واکنش های رونویسی معکوس را امکان پذیر می کنند و از زمان کشف آنها به طور گسترده توسط محققان در انواع کاربردهای زیست شناسی مولکولی مورد استفاده قرار می گیرند.

*شرکت درمان نگار آیندگان وارد کننده انواع کیت های Addbio از کره جنوبی برای تکنیک PCR های مختلف می باشد که در قسمت فروش آنلاین می توانید خرید کنید.

*شرکت درمان نگار آیندگان ارائه دهنده دستگاه های PCR و Real Time PCR وارداتی است که می توانید در سایت مشاهده فرمایید.

واکنش های RT شامل معرف های زیر است:

الگوی RNA :RNA را می توان از انواع نمونه های بیولوژیکی تخلیص کرد. RNA ذاتا ناپایدار است و باید اقدامات احتیاطی جدی برای جلوگیری از تخریب در طول فرایند استخراج و مراحل بعدی انجام شود. کیفیت و خلوص RNA در RT-PCR بسیار مهم است.

آنزیم‌های ترانس کریپتاز معکوس: DNA پلیمرازهای هدایت‌شده RNA هستند که از رتروویروس‌ها مشتق شده‌اند که می‌توانند قطعات تک رشته‌ای cDNA را مکمل الگوی RNA  سنتز کنند.

Oligo dt: پرایمرهایی که به طور انتخابی به دم های پلی A در mRNA متصل می شوند. فقط RNA های پلی آدنیله در یک واکنش رونویسی معکوس خواهند شد. cDNA حاصل را می توان در واکنش های PCR متعدد استفاده کرد و امکان تجزیه و تحلیل بیش از یک ژن را فراهم می کند.

 Random hexamer: مخلوطی از پرایمرهای هگزانوکلئوتیدی تصادفی که به توالی ها در سراسر RNA هدف متصل می شوند و منجر به رونویسی معکوس RNA های پلی آدنیله و غیر پلی آدنیله می شوند.

cDNA تصادفی پرایم شده با هگزامر را می توان در چندین واکنش PCR استفاده کرد که امکان تجزیه و تحلیل بیش از یک ناحیه هدف را فراهم می کند.

Sequence-specific: پرایمرهایی که به توالی ژنی مشخص متصل می شوند و منجر به رونویسی معکوس یک mRNA خاص می شوند. هنگام استفاده از آغازگرهای توالی خاص، یک واکنش RT جدید باید برای هر ژن مورد نظر انجام شود.

چهار نوکلئوتید: dNTP – dATP، dTTP، dCTP و dGTP بلوک های سازنده رشته های cDNA هستند که توسط رونویسی معکوس سنتز می شوند.

مهارکننده Rnase: افزودن یک مهارکننده RNase به حفظ  RNA در برابر  فعالیت ریبونوکلئازهای تجزیه کننده RNA موجود در محیط آزمایشگاه کمک می کند.

بافر واکنش: شرایط بهینه برای فعالیت آنزیم در واکنش RT-PCR  فراهم می کند.

کاربرد های RT-PCR:

• تشخیص بیماریهای عفونی
• شناسایی گونه های ناشناخته
• مطالعه جهش و سلول درمانی
• ابزارهای مهندسی ژنتیک و مطالعه ویروسی

ONE STEP:

در RT- PCR تک مرحله ای همان طور که از نام آن پیداست, سنتز cDNA و PCR در یک میکروتیوب انجام می شود. این روش به ساده سازی آزمایش, کاهش تنوع و آلودگی کمک بسیاری می کند.

TWO STEP:

RT-PCR دو مرحله ای مستلزم دو واکنش جداگانه است که با سنتز cDNA شروع می شود و به دنبال آن بخشی از cDNA حاصل توسط PCR در میکروتیوب جداگانه دیگری تکثیر می شود. بنابراین RT-PCR دو مرحله ای برای تشخیص چندین زن در یک نمونه RNA مفید است. جداسازی واکنش های RT و PCR به بهینه سازی شرایط واکنش برای هر مرحله و همچنین انعطاف پذیری با پرایمرهای اولیگو dt, رندوم هگزامر, پرایمرهای اختصاصی ژن و تنظیم PCR به عنوان مثال (انتخاب DNA پلیمراز – اجزای PCR) امکان پذیر است.

RT-PCR دو مرحله ای سبب طولانی شدن پروسه کاری و آنالیز نمونه اضافی و ممکن است میزان آلودگی و تغییر نتایج را افزایش بدهد.

مزایای ONE STEP PCR:

• راه اندازی سریع و آسان
• روش ارزان و سریع
• احتمال آلودگی کمتر
• کاهش خطای پیپتاژ کردن
• دقت و ویژگی بالاتر

ویژگی ها	تک مرحله ای	دو مرحله ای
تنظیم واکنش	واکنش ترکیبی رونویسی معکوس و PCR	واکنش جداگانه رونویسی معکوس و PCR
پرایمر	پرایمرهای اختصاصی ژن	پرایمرها Oligo dt Randomhexamer اختصاصی ژن
کاربرد	تجزیه و تحلیل ژن های کم	تجزیه و تحلیل ژن های متعدد
مزایا	راه اندازی سریع و آسان است روش ارزان و سریع است احتمال آلودگی کمتر است کاهش خطای پیپتاژ کردن دقت و ویژگی بالاتر است مناسب برای تکثیر بالا با قابلیت تکرار زیاد می باشد.	امکان ذخیره cDNA برای مدت طولانی راندمان و دقت بالاتری نسبت به تک مرحله دارد و امکان تشخیص الگوهای بزرگ تر در هر مرحله از واکنش در مقایسه با روش تک مرحله ای اتصال غیر اختصاصی  دایمر پرایمر کمتر است.
معایب	بهینه سازی دو واکنش جداگانه غیرممکن است امکان تشخیص الگوهای کمتر در مخلوط واکنش می باشد. احتمال بیشتر پرایمر – دایمر و اتصال غیراختصاصی نیاز به الگوی بزرگتر برای تشخیص است.	استفاده از چندین میکروتیوب در مراحل پیپتینگ فرایندی طولانی و زمان بر است افزایش آلودگی عدم ذخیره سازی و تجزیه و تحلیل cDNA تشکیل شده در طول واکنش

 

 

 مزایای Two STEP PCR:

• امکان ذخیره cDNA
• راندمان و دقت بالاتری نسبت به تک مرحله دارد و امکان تشخیص الگوهای بزرگ تر در هر مرحله از واکنش
• در مقایسه با روش تک مرحله ای اتصال غیر اختصاصی دایمر پرایمر کمتر است.

 

معایب RT- PCR  دو مرحله ای نسبت به RT-PCR  تک مرحله ای:

• احتمال آلودگی بیشتر
• فرآیندی طولانی و خسته کننده تر از تک مرحله ای است نیاز به کاربری باتجربه و آموزش دیده دارد.

RT-qPCR چیست:

RT-qPCR یا PCR رونویسی معکوس کمی، اثرات رونویسی معکوس و PCR کمی یا Real-time PCR را برای تکثیر و شناسایی ژن های خاص ترکیب می کند. RT-qPCR کاربردهای مختلفی از جمله تعیین کمیت سطح بیان ژن، اعتبارسنجی تداخل RNA (RNAi) و شناسایی پاتوژن هایی مانند ویروس ها دارد. روش‌های رایج برای تولید سیگنال فلورسنت که برای اندازه‌گیری کمیت DNA در این تکنیک استفاده می‌شود.

PCR رونویسی معکوس کمی (RT-qPCR) شامل تشخیص و تعیین کمیت RNA است. این فرآیند با رونویسی معکوس RNA تام یا mRNA به DNA مکمل (cDNA) توسط آنزیم ترانس کریپتاز معکوس انجام می شود و به دنبال آن تکثیر و شناسایی اهداف خاص این cDNA با استفاده از تکنیکی به نام PCR کمی (qPCR) یا Real-time PCR انجام می شود. در هر چرخه در طول این PCR، مقدار DNA در زمان واقعی با استفاده از انواع مختلف فلورسنت اندازه گیری می شود. رایج‌ترین روش‌ها برای تولید سیگنال فلورسنت، استفاده از پروب‌های هیدرولیز مانند پروب‌های TaqMan® یا رنگ‌های سایبرگرین است.

انتخاب نوع فلورسنت به عواملی مانند کاربرد، هزینه و اینکه آیا سنجش تک پلکس یا مالتی پلکس است بستگی دارد. رنگ‌های متصل شونده به DNA برای سنجش‌های تک پلکس و کم توان ترجیح داده می‌شوند زیرا طراحی آن‌ها آسان‌تر است، زمان تنظیم کمتری دارند و مقرون‌به‌صرفه‌تر هستند. پروب‌های فلورسنت معمولاً در سنجش‌های مولتی پلکس با کارایی بالا استفاده می‌شوند.

RT-qPCR چه کاربردهایی دارد؟

• میزان بیان ژن را تعیین می کند.
• اعتبار سنجی RNA مداخله گر برا مطالعه از دست دادن عملکرد ژن های انتخابی
• برای تشخیص بیماری های عفونی عوامل بیماری زا مانند ویروس ها را شناسایی می کند.
• تشخیص ارگانیسم های اصلاح ژنتیکی شده

RT-qpcr درهر دو روش یک مرحله ای یا دومرحله انجام می شود. انتخاب تک مرحله ای / دومرحله ای به عوامل مختلفی مانند: هزینه, کاربرد و نوع سنجش بستگی دارد.

One-Step RT-qPCR

در RT-qPCR یک مرحله ای، رونویسی معکوس یا سنتز cDNA و qPCR در یک میکروتیوب با استفاده از پرایمرهای  توالی خاص برای تکثیر یک ژن خاص انجام می شود. ترانس کریپتازهای معکوس اصلاح شده ژنتیکی معمولاً در سنجش یک مرحله‌ای استفاده می‌شوند زیرا دمای بالاتری را که برای اتصال پرایمرهای توالی خاص لازم است را تحمل می‌کنند. هنگامی که کمی سازی مکرر همان ژن انجام می شود، به ویژه در کاربردهای تشخیصی و توان عملیاتی بالا، یک سنجش یکی دیگر از مواردی که در انتخاب سنجش های یک مرحله ای کیفیت و فراوانی RNA مورد توجه قرار می گیرد. از آنجایی که cDNA سنتز شده در طول واکنش را نمی توان به صورت جداگانه ذخیره کرد، نمونه های بیشتری از RNA اصلی ممکن است برای تکرار سنجش مورد نیاز باشد.

Two-Step RT-qPCR

در RT-qPCR دو مرحله‌ای، رونویسی معکوس و واکنش‌های qPCR در تیوب های جداگانه ای  که بافرها و معرف‌های جداگانه دارند انجام می‌شود. هگزامرهای تصادفی، پرایمرهای oligo-dT و/یا پرایمرهای اختصاصی ژن ممکن است در سنجش دو مرحله ای استفاده شوند. داشتن بافرها و معرف‌های جداگانه، انعطاف‌پذیری بیشتری را در انتخاب آنزیم‌های ترانس کریپتاز معکوس و معرف‌های PCR، با گزینه‌های بیشتر برای بهینه‌سازی و بهبود راندمان تکثیر نمونه های  دشوار فراهم می‌کند. cDNA پایدارتر که در مرحله اول سنتز می‌شود، می‌تواند بیشتر خالص شود تا برای استفاده در آینده ذخیره شود یا ممکن است برای تعیین کمیت ژن‌های متعدد از یک نمونه استفاده شود.

عکس پایین روش RealTime-PCR برای نمونه سارس رو نشان می دهد.