توالی یابی نسل جدید (Next Generation Sequencing)

در سال ۲۰۰۷ تحولی در دنیای ژنومیکس پدید آورد، روشی کاملا جدید برای تعیین توالی DNA معرفی نمود و هزینه و زمان موردنیاز برای توالی یابی ژنوم را به شدت کاهش داد. مثالی که برای اهمیت این روش می‌توان عنوان کرد آن است که پروژه ژنوم انسان ۱۰ سال طول کشید و بیش از ۳ میلیارد دلار بودجه مصرف کرد؛ این در حالی است که امروزه توالی یابی نسل جدید می‌تواند در عرض یک روز کل ژنوم انسان را با صرف هزینه‌ای کمتر از 2000 دلار توالی یابی کند. یکی از علل این موضوع آماده‌سازی سریع‌تر نمونه نسبت به تکنیک‌های پیشین است؛ به عنوان مثال دیگر نیازی به تولید کتابخانه‌های DNA در باکتری‌ها نیست.علاوه بر صرفه‌جویی در هزینه و زمان، پس از کشف این تکنیک‌ها تعداد ژنوم‌های توالی یابی شده نیز افزایش قابل توجهی داشته است.
اساس تکنیک توالی یابی Illumina تکنیک دی دئوکسی است، اما از نوآوری‌های فراوان دیگری نیز بهره برده است. در این تکنیک علی‌رغم پایین بودن طول توالی‌های خوانده شده، دیتای بیشتری نسبت به تکنیک توالی یابی ۴۵۴ تولید می‌شود.طی این فرایند، از نوکلئوتیدهای متصل به یک مولکول فلورسنت قابل جداسازی که هر کدام از بازها رنگ متفاوتی دارند و نیز یک ماده شیمیایی خاتمه دهنده زنجیره استفاده می‌شود. به جای نبود گروه ’3-OH که در توالی یابی در دئوکسی عادی باعث خاتمه زنجیره می‌شود، در این تکنیک نوکلئوتیدها دارای یک گروه شیمیایی هستند که می‌تواند ’3-OH را بلاک کرده و از ادامه همانندسازی توسط DNA پلیمراز جلوگیری کند. این گروه‌ها را می‌توان به طریق آنزیمی جداسازی کرد. همانند سایر تکنولوژي‌های توالی یابی نسل جدید، اولین گام در این تکنولوژي، آماده‌سازی DNA به منظور تکثیر توسط PCR است. در واقع این تکنیک‌ها به جای این که از محصولات PCR یا توالی‌های کلون‌شده استفاده کنند، کار خود را با DNA ژنومی آغاز می‌نمایند. DNA استخراج شده به قطعات کوچکتری که طولشان در حدود ۲۰۰ تا ۶۰۰ جفت‌باز است، شکسته می‌شود. توالی‌های کوتاهی که Adaptor نام دارند، به قطعات DNA متصل می‌گردند. سپس مولکول‌های DNA دناتوره می‌شوند تا تک‌رشته‌ای شوند. پس از طی این مراحل آماده‌سازی، قطعات DNA به سطح یک فلوسل (Flow Cell) اتصال می‌یابند و سپس سطح فلوسل شسته می‌شود تا DNAهای متصل نشده در سطح باقی نمانند.. سطح فلوسل دارای پرایمرهایی است که مکمل Adaptorهای متصل شده به سطح می‌باشند. Adaptor ها و پرایمرها باید به حد کافی از هم دور باشند تا شناساگر موجود در کف فلوسل، آن‌ها را در موقعیت‌های جداگانه‌ای تشخیص دهد. مشابه توالی یابی ۴۵۴، قطعاتDNA ثابت شده در سطح فلوسل، در اثر انکوبه شدن با DNA پلیمراز و دئوکسی نوکلئوتیدها طی فرایندی به نام Bridge Sequencing همانندسازی می‌شوند. پرایمرهای موردنیاز برای تکثیر قطعات DNA به فلوسل متصل هستند؛ در نتیجه DNA در اثر اتصال به پرایمر، فرمی پل مانند پیدا می‌کند. این قطعات تکثیر و رهاسازی و سپس به منظور تک‌رشته‌ای شدن دناتوره می‌شوند تا توده‌ای از قطعات DNA مشابه را تشکیل دهند.