توالی یابی نسل جدید (Next Generation Sequencing= NGS)

در سال ۲۰۰۷ تحولی در دنیای ژنومیکس پدید آورد، روشی کاملا جدید برای تعیین توالی DNA معرفی نمود و هزینه و زمان موردنیاز برای توالی یابی ژنوم را به شدت کاهش داد. مثالی که برای اهمیت این روش می‌توان عنوان کرد آن است که پروژه ژنوم انسان ۱۰ سال طول کشید و بیش از ۳ میلیارد دلار بودجه مصرف کرد؛ این در حالی است که امروزه توالی یابی نسل جدید می‌تواند در عرض یک روز کل ژنوم انسان را با صرف هزینه‌ای در حدود ۵۰۰۰ دلار توالی یابی کند. یکی از علل این موضوع آماده‌سازی سریع‌تر نمونه نسبت به تکنیک‌های پیشین است؛ به عنوان مثال دیگر نیازی به تولید کتابخانه‌های DNA در باکتری‌ها نیست.علاوه بر صرفه‌جویی در هزینه و زمان، پس از کشف این تکنیک‌ها تعداد ژنوم‌های توالی یابی شده نیز افزایش قابل توجهی داشته است.
اساس تکنیک توالی یابی Illumina تکنیک دی دئوکسی است، اما از نوآوری‌های فراوان دیگری نیز بهره برده است. در این تکنیک علی‌رغم پایین بودن تعداد توالی‌های خوانده شده، محصولات بیشتری نسبت به تکنیک توالی یابی ۴۵۴ تولید می‌شود. طی این فرایند، از نوکلئوتیدهای متصل به یک مولکول فلورسنت قابل جداسازی که هر کدام از بازها رنگ متفاوتی دارند و نیز یک ماده شیمیایی خاتمه دهنده زنجیره استفاده می‌شود. به جای نبود گروه ’۳-OH که در توالی یابی در دئوکسی عادی باعث خاتمه زنجیره می‌شود، در این تکنیک نوکلئوتیدها دارای یک گروه شیمیایی هستند که می‌تواند ’۳-OH را بلاک کرده و از ادامه همانندسازی توسط DNA پلیمراز جلوگیری کند. این گروه‌ها را می‌توان به طریق آنزیمی جداسازی کرد. همانند سایر تکنولوژی‌های توالی یابی نسل جدید، اولین گام در این تکنولوژی، آماده‌سازی DNA به منظور تکثیر توسط PCR است. در واقع این تکنیک‌ها به جای این که از محصولات PCR یا توالی‌های کلون‌شده استفاده کنند، کار خود را با DNA ژنومی آغاز می‌نمایند. DNA استخراج شده به قطعات کوچکتری که طولشان در حدود ۲۰۰ تا ۶۰۰ جفت‌باز است، شکسته می‌شود. توالی‌های کوتاهی که Adaptor نام دارند، به قطعات DNA متصل می‌گردند. سپس مولکول‌های DNA دناتوره می‌شوند تا تک‌رشته‌ای شوند. پس از طی این مراحل آماده‌سازی، قطعات DNA به سطح یک فلوسل (Flow Cell) اتصال می‌یابند و سپس سطح فلوسل شسته می‌شود تا DNAهای متصل نشده در سطح باقی نمانند.. سطح فلوسل دارای پرایمرهایی است که مکمل Adaptorهای متصل شده به سطح می‌باشند. Adaptor ها و پرایمرها باید به حد کافی از هم دور باشند تا شناساگر موجود در کف فلوسل، آن‌ها را در موقعیت‌های جداگانه‌ای تشخیص دهد. مشابه توالی یابی ۴۵۴، قطعاتDNA ثابت شده در سطح فلوسل، در اثر انکوبه شدن با DNA پلیمراز و دئوکسی نوکلئوتیدها طی فرایندی به نام Bridge Sequencing همانندسازی می‌شوند. پرایمرهای موردنیاز برای تکثیر قطعات DNA به فلوسل متصل هستند؛ در نتیجه DNA در اثر اتصال به پرایمر، فرمی پل مانند پیدا می‌کند. این قطعات تکثیر و رهاسازی و سپس به منظور تک‌رشته‌ای شدن دناتوره می‌شوند تا توده‌ای از قطعات DNA مشابه را تشکیل دهند.

در تکنیک Illumina آماده‌سازی DNA برای فرایند تکثیر با استخراج و تقسیم‌بندی نمونه به قطعات کوچکتر انجام می‌شود. adaptorها به انتهای قطعات متصل شده و سپس به الیگونوکلئوتیدهای مکمل در سطح فلوسل اتصال می‌یابند. اتصال قطعات به نحوی صورت می‌گیرد که فاصله آن‌ها از یکدیگر برای شناسایی توسط دستگاه شناساگر موجود در کف فلوسل قابل تشخیص باشد. هر مولکول الگو تکثیر و سپس دناتوره می‌شود تا تک‌رشته‌ای شود. توالی، پس از اتصال پرایمر به یکی از انتهاهای رشته الگو و تعیین باز به باز توالی حین سنتز رشته جدید صورت می‌گیرد (برای توضیحات بیشتر به متن مراجعه کنید). فرایند توالی یابی سپس به ترتیب زیر انجام می‌گیرد: چهار نوکلئوتید لیبل شده با رنگ‌های فلورسنت به همراه آنزیم DNA پلیمراز به میلیاردها توده DNA که روی یک اسلاید ثابت شده‌اند، افزوده می‌شوند. در هر توده تنها نوکلئوتیدهای مکمل توالی الگو به صورت کوالانسی متصل و نوکلئوتیدهای متصل نشده شسته می‌شوند. سپس دوربینی دیجیتال با رزلوشن بالا، پس از تابیده شدن لیزر و فعال شدن رنگ‌های فلورسنت، تصویری را ثبت می‌کند که مشخص کننده نوکلئوتیدهای اضافه شده به زنجیره در هر توده است. لیبل فلورسنت و گروه بلاک‌کننده ’۳-OH به صورت آنزیمی جداسازی می‌شوند و فرایند به دفعات تکرار می‌گردد. به این نحو، میلیاردها واکنش توالی یابی به طور همزمان انجام می‌گیرند. با ردیابی تغییرات رنگ در هر توده، توالی DNA موجود در هر نقطه معین می‌شود. با اینکه هر کدام از توالی‌ها به تنهایی نسبتا کوتاه هستند (حدود ۲۰۰ نوکلئوتید)، میلیاردها عدد از آن‌ها به طور همزمان انجام می‌شوند تا در عرض یک روز، چندین ژنوم انسانی توالی یابی شود. بررسی باز به باز توالی باعث دقت بالای این متد شده است.

اساس توالی یابی Illumina ؛ این واکنش به صورت همزمان در میلیاردها توده DNA انجام می‌گیرد. در این متد یک دوربین رنگی دیجیتال که به سرعت تمام توده‌های DNA را در هر نوبت از اتصال نوکلئوتیدها اسکن می‌کند، به کار می‌رود. سپس توالی هر توده از روی الگوی تغییر رنگ‌ها که با پیشرفت گام به گام واکنش همانندسازی رخ می‌دهد، تعیین می‌گردد. هر دور از الحاق نوکلئوتید تغییریافته و جداسازی بلاک کننده ’۳-OH و مولکول فلورسنت، کمتر از یک ساعت به طول می‌انجامد. هر توده موجود در اسلاید نیز حاوی کپی‌های فراوانی از قطعات مختلف تصادفی موجود در ژنوم است. در مرحله آماده سازی توده‌ها، توالی DNA مشخصی که توسط پژوهشگر تعیین می‌شود، به هر کدام از نسخه‌های موجود در هر توده افزوده می‌شوند و پرایمری که مکمل این توالی است، برای شروع فرایند همانندسازی توسط DNA پلیمراز مورد استفاده قرار می‌گیرد.

کمپانی‌های انجام دهنده تست NGS:
NovoGene
Genomescan