توالی یابی DNA یا تعیین توالی دی ان ای چیست؟

 (DNA Sequencing)

توالی‌یابی DNA به تکنیک آزمایشگاهی عمومی برای تعیین توالی دقیق نوکلئوتیدها در یک مولکول مارپیچ دوگانه DNA اشاره دارد. توالی بازها (اغلب با حروف اول نام شیمیایی آنها: A، T، C و G نامیده می شود) اطلاعات بیولوژیکی را رمزگذاری می کند که سلول ها برای توسعه و عملکرد از آنها استفاده می کنند. ایجاد توالی DNA برای درک عملکرد ژن ها و سایر بخش های ژنوم کلیدی است. در حال حاضر چندین روش مختلف برای تعیین توالی DNA موجود است که هر کدام ویژگی های خاص خود را دارند.

همانطور که گفته شد نوکلئوتید ها شامل چها باز شیمیایی از جمله آدنین (A)، تیمین (T)، سیتوزین (C) و گوانین (G) در قطعه ای از دی ان ای هستند که همیشه آدنین با تیمین و سیتوزین با گوانین جفت می شود و به این فرایند توالی یابی DNA یا (DNA sequencing) می گویند. امروزه با به کار بردن ابزارهای مناسب، توالی یابی قطعه ای از DNA کار بسیار ساده ای است اگرچه توالی یابی کل ژنوم یعنی تمام DNA هنوز کاری پیچیده به نظر می‌رسد این کار نیازمند شکستن دی ان ای به قطعات کوچکتر است.

سپس باید این قطعات کوچک توالی یابی شده و در کنار هم در قالب یک مجموعه بسیار بلند و طولانی قرار بگیرد. اگرچه باید اذعان داشت که به واسطه تلاش هایی که در دو دهه گذشته انجام شده توالی یابی ژنوم بسیار سریعتر و راحت تر از آنچه در پروژه توالی یابی ژنوم انسان اتفاق افتاده صورت می گیرد.
در اینجا تمرکز خود را بر روی یکی از روش های پرکاربرد برای تعیین توالی DNA به نام توالی یابی سنگر قرار داده ایم.

اجزاء مولکول DNA

توالی یابی سنگر یا روش خاتمه دادن زنجیره ای (Sanger Sequencing)

بخش هایی از دی ان ای که طولی بیشتر از ۹۰۰ جفت باز دارند معمولاً با استفاده از تکنیک ای به نام توالی یابی سنگر یا روش خاتمه دادن زنجیره ای توالی یابی می شود. این روش توسط یک بیوشیمی دان انگلیسی به نام فرد سنگر و همکارانش در سال ۱۹۷۷ ابداع شد.
در پروژه ژنوم انسانی از تکنیک توالی یابی سنگر برای توالی یابی قطعات به نسبت کوچکتر دی ان ای نیز استفاده شد. البته این قطعات DNA الزاماً کمتر از ۹۰۰ جفت باز طول نداشتند ولی محققان می توانند هر قطعه طولانی را با استفاده از چند بار توالی یابی سنگر توالی یابی کند. پس از آن توالی قطعات بر اساس بخش هایی که همپوشانی دارند، پشت سر هم قرار گرفته و ساختار کلی ژنوم به مرور به دست می آید.

اگرچه امروزه برای توالی یابی ژنوم از روش‌های سریعتر و ارزانتر استفاده می شود ولی همچنان توالی یابی سنگر یکی از پرکاربردترین روش های توالی یابی قطعات دی ان ای است. از جمله می‌توان به توالی یابی قطعات مشخصی از دی آن ای برای کلونینگ و یا قطعات به وجود آمده دی آن ای از طریق پی سی آر اشاره کرد. توالی یابی سنگر (Sanger Sequencing) شامل کپی‌کردن قسمت خاصی از دی ان ای به تعداد بسیار بالاست. موادی که در این تکنیک استفاده می‌شود مشابه مواد مصرفی در پی سی آر و یا فرایند تکثیر دی ان ای در جانداران است. این مواد عبارتند از:

• آنزیم دی ان ای پلیمراز
• پرایمر که قطعه کوتاهی از دی ان ای تک رشته ای است که به الگوی دی ان ای متصل شده و به عنوان نقطه شروع برای پلیمراز تلقی می شود
• چهار نوکلئوتید استفاده شده در دی ان ای که عبارتند از گوانین، سیتوزین، آدنین و تیمین
• و نهایتاً قالب یا تمپلیت DNA که قرار است تکثیر شود

و البته تکنیک توالی یابی سنگر حاوی یک ماده خاص دیگر نیز هست و این ماده پایان دهنده زنجیره ای (Chain Terminator) و یا نسخه دی دی اُکسی(ddNTP) هر یک از چهار نوکلئوتید استفاده شده در دی ان ای می باشد که هر کدام با استفاده از رنگ متفاوتی علامت گذاری شده اند.

دی دی اکسی نوکلئوتیدها بسیار شبیه دی اکسی نوکلئوتید هستند با این تفاوت که آنها بر روی کربن ۳′ حلقه قندی خود گروه هیدروکسیل ندارند. در نوکلئوتیدهای معمولی گروه هیدروکسیل روی کربن ۳′ همانند یک قلاب عمل می کند و اجازه می دهد که نوکلئوتیدهای دیگر به زنجیره اضافه شوند.

وقتی که دی دی اکسی نوکلئوتید به زنجیره اضافه می شود دیگر هیدروکسیل وجود ندارد، بنابراین نوکلئوتیدهای دیگری نمی توانند به زنجیره اضافه شوند. در این حالت زنجیره پایان می‌یابد و آخرین نقطه زنجیره حاوی دی دی اکسی نوکلئوتید خواهد بود و هر دی دی اکسی نوکلئوتید نیز با توجه به باز خاص خود دارای یک رنگ مشخص است.

روش انجام توالی یابی سنگر

DNA مورد نظر برای توالی یابی به همراه پرایمر، دی ان ای پلیمراز، نوکلئوتید ها و همچنین دی دی اکسی نوکلئوتید هایی که با استفاده از رنگ علامت دار شده اند درون یک میکروتیوب ترکیب می‌شوند. نکته اینجاست که مقدار دی دی اکسی نوکلئوتید از نوکلئوتید های معمولی بسیار کمتر است. سپس دما بالا میرود تا دو رشته دی ان ای واسرشته شود، سپس دما پایین می‌آید تا پرایمر بتواند به دی ان ای تک رشته ای متصل شود.

پس از اینکه پرایمر به DNA تک رشته ای متصل شد، دوباره دما بالا می رود تا پلیمراز بتواند ساختن دی ان ای را از جایی که پرایمر متصل شده آغاز کند. دی ان ای پلیمراز پس از آن شروع می‌کند به اضافه کردن نوکلئوتید ها به دی ان ای و ادامه دادن زنجیره تا جایی که یک دی دی اکسی نوکلئوتید به جای یک نوکلئوتید عادی به زنجیره اضافه کند. در این مرحله دیگر امکان اضافه شدن نوکلئوتیدهای بعدی وجود نخواهد داشت، بنابراین دی دی اکسی نوکلئوتید آخرین نقطه زنجیره ای ساخته شده خواهد بود.

الکتروفورز کپیلاری یا الکتروفورز مویینه (Capillary-Electrophoresis)

کوچکترین قطعه DNA که تنها شامل یک دی دی اکسی نوکلئوتید پس از پرایمر میشود، زودتر از همه از خط پایان می گذرد. پس از آن قطعه ای که شامل یک نوکلئوتید و یک دی دی اکسی نوکلئوتید است از خط پایان گذشته و به همین صورت قطعات به ترتیب طول، از کوتاه ترین تا بلندترین قطعه از خط پایان عبور می کند. بنابراین با رنگ هایی که توسط یک آشکارساز یکی پس از دیگری خوانده می شود می توان توالی دی ان ای را مشخص کرد. اطلاعات خوانده شده توسط دستگاه شامل قله هایی است که هرکدام شدت نور فلورسنس تشخیص داده شده را مشخص می کنند.

کاربردها و محدودیت های توالی یابی سنگر

• توالی یابی سنگر امکان توالی یابی قطعات بلند دی ان ای را تا حدود ۹۰۰ جفت باز فراهم می کند.
• این روش برای توالی یابی قطعات مجزایی از DNA مانند دی ان ای های کپی شده در پی سی آر (PCR) و یا پلاسمیدهای باکتریایی استفاده می‌شود.

اگرچه این روش برای پروژه های بزرگتر مانند توالی یابی کل ژنوم یا متاژنوم نامناسب و گران قیمت است برای چنین پروژه هایی روش های مناسب تر، کارا تر و سریع تری مانند ان جی اس ابداع شده و استفاده می شود.

مطالب پیشنهادی:  Dna sequencing